ERK1_2通过调控NAD...线粒体分裂在结肠炎中的作用_翟晓明.pdf

20232023 年3 月第 54 卷第 3 期年3 月第 54 卷第 3 期197研究论著研究论著新医学 新医学 ERK1/2 通过调控 NADPH 氧化酶和线粒体分裂在结肠炎中的作用翟晓明 谭嗣伟 易玉君 刘慧玲 郭佳翔 吴淑云 陶金【摘要】目的研究细胞外信号调节激酶 1 和 2（ERK1/2）通过调控 NADPH 氧化酶（Nox）和线粒体分裂在结肠炎中的作用。方法3%葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导小鼠急性结肠炎。将 30 只 C57BL/6J 小鼠用随机数表法分为 6 组：Control 组、3%DSS 组、1%二甲亚砜（DMSO）组、ERK1/2 抑制剂（PD98059）组、3%DSS+1%DMSO组、3%DSS+PD98059 组，每组 5 只。评估 Control 组和 3%DSS 组小鼠体重变化、结肠长度改变、疾病活动指数和结肠组织病理学改变，检测小鼠结肠黏膜 ERK1/2、磷酸化（p）-ERK1/2、Nox1 和 Nox2 表达水平。1%DMSO 组、3%DSS+1%DMSO组给予腹腔注射1%DMSO；PD98059组、3%DSS+PD98059组小鼠给予腹腔注射PD98059。评估4组小鼠结肠组织病理学改变，检测 Nox1、Nox2、动力相关蛋白 1（DRP1）、p-DRP1-S616 和 p-DRP1-S637 等线粒体分裂相关蛋白表达水平的改变。透射电镜观察 Control 组和 3%DSS 组小鼠结肠上皮细胞线粒体分裂情况。免疫荧光双染分析 2 组小鼠结肠黏膜中 Nox2 与线粒体外膜转位酶 TOM 复合体（TOMM20）共定位情况。分析 2 组小鼠结肠黏膜DRP1与Nox2mRNA相对表达量的相关性。结果与Control组相比，3%DSS组小鼠体重下降、结肠长度缩短、疾病活动指数增加和结肠组织病理学评分升高，结肠黏膜 p-ERK1/2、Nox1 和 Nox2 表达增加（P 均 0.05）。结肠炎小鼠结肠上皮细胞中的线粒体分裂增加，结肠黏膜的DRP1和Nox2共定位增加，两者mRNA相对表达呈正相关（r=0.678，P0.05）。ERK1/2 抑制剂 PD98059 改善结肠炎小鼠结肠组织病理学变化，并且下调结肠黏膜 Nox1、Nox2、DRP1、p-DRP1-S616 的表达。结论 抑制 ERK1/2 可能通过减轻 Nox 表达和线粒体分裂，改善结肠炎。【关键词】溃疡性结肠炎；细胞外信号调节激酶 1 和 2；NADPH 氧化酶；线粒体分裂The role of ERK1/2 in colitis through regulation of NADPH oxidase and mitochondrial fission Zhai Xiaoming，Tan Siwei，Yi Yujun，Liu Huiling，Guo Jiaxiang，Wu Shuyun，Tao Jin.Department of Gastroenterology,the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangzhou 510630,ChinaCorresponding author，Tao Jin，E-mail:【Abstract】Objective Toinvestigatetheroleofextracellularsignalregulatedkinase1/2（ERK1/2）incolitisthroughtheregulationofNADPHoxidaseandmitochondrialfission.Methods Micemodelsofacutecolitiswereinducedby3%dextransulfatesodium（DSS）.ThirtyC57BL/6Jmicewererandomlydividedintosixgroupsbyrandomnumbertablemethod：controlgroup，3%DSSgroup，1%dimethylsulfoxide（DMSO）group，ERK1/2inhibitor（PD98059）group，3%DSS+1%DMSOgroupand3%DSS+PD98059group，withfivemiceineachgroup.Thechangesofbodyweight，coloniclength，diseaseactivityindexandcolonichistopathologicalchangesofmiceinthecontroland3%DSSgroupswereevaluated，andtheexpressionlevelsofERK1/2，p-ERK1/2，Nicotinamideadeninedinucleotidephosphateoxidase1（Nox1）andNox2incolonicmucosaofmiceweredetected.Micein1%DMSOand3%DSS+1%DMSOgroupswereintraperitoneallyinjectedwith1%DMSO.MiceinthePD98059and3%DSS+PD98059groupswereintraperitoneallyinjectedwithPD98059.Thecolonichistopathologicalchangeswereevaluatedamongfourgroups，andtheexpressionlevelsofNox1，Nox2，Dynaminrelatedprotein1（DRP1），p-DRP1-S616andp-DRP1-S637mitochondrialfissionrelatedproteinsweredetected.Mitochondrialfissionofcolonicepithelialcellsinthecontroland3%DSSgroupswasobservedbytransmissionelectronmicroscopy.Theco-localizationofNox2andmitochondrialoutermembranetranslocatorenzymeTOMcomplex（TOMM20）incolonicmucosaofmiceintwogroupswasanalyzedbydouble-immunofluorescencestaining.ThecorrelationbetweenrelativeexpressionlevelsofDRP1andNox2mRNAinmousecolonicmucosawasanalyzedintwogroups.Results Comparedwiththecontrolgroup，miceinthe3%DSSgroupexhibitedbodyweightloss，shortenedcoloniclength，increaseddiseaseactivityindexandincreasedcolonic基金项目：国家自然科学青年科学基金项目（81800458）；国家自然科学基金面上项目（82170569）作者单位：510630 广州，中山大学附属第三医院消化内科通信作者，陶金，E-mail:DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2023.03.00720232023 年3 月第 54 卷第 3 期年3 月第 54 卷第 3 期198新医学 新医学 溃疡性结肠炎（UC）是一种病因未明，主要累及结肠和直肠黏膜的慢性炎症性肠病11。Ords等（2012 年）认为肠道上皮屏障破坏、肠道微生物改变、免疫功能紊乱、遗传异质性和环境等因素可能参与 UC 的发生发展，具体机制尚未明确。细胞外信号调节激酶 1 和 2（ERK1/2）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成员，可介导胞外信号向细胞内传导，具有调节细胞增殖、分化、凋亡及蛋白质磷酸化等作用22。Waetzig 等（2002 年）研究显示与正常对照相比，UC 患者炎性结肠黏膜组织的ERK1/2 活化增强。在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导小鼠结肠炎模型中，人脐带间充质干细胞通过抑制中性粒细胞 ERK1/2 磷酸化改善肠道炎症33。这些研究提示 ERK1/2 可能参与 UC 的发生发展。肠道中过量活性氧（ROS）的产生是肠道黏膜屏障损伤的重要因素。NADPH 氧化酶（Nox）是肠道黏膜组织 ROS 的关键来源，其家族成员有 NOX1-5、DUOX1 和 DUOX2（小鼠中被称为 Nox1-4、Duox1和Duox2，其中小鼠Nox5基因缺失）。动力蛋白相关蛋白 1（DRP1）是参与线粒体分裂的主要蛋白，DRP1 中 S616 位点的磷酸化可以促进线粒体碎片化，而 DRP1 中 S637 位点的磷酸化则抑制线粒体分裂。研究发现，ERK1/2 可以促进 DRP1 介导的线粒体分裂44。ERK1/2 调控 Nox 表达和线粒体分裂在结肠炎中尚未见报道。材料与方法一、材 料1.实验动物1.实验动物无特定病原体（SPF）级别的C57BL/6J小鼠30只，雌雄各半，68 周龄，体重 2025 g，购自广东药康公司。本动物实验伦理经华南农业大学实验动物伦理委员会审批通过（2022d028）。2.主要试剂与抗体 2.主要试剂与抗体 DSS（MP Biomedicals，美国）、PD98059（MCE，US）、DAB 显色液（Vector）、HE 染液（北京雷根生物技术有限公司）、-actin抗体（Santa Cruz，美国）、ERK1/2 和磷酸化（p）-ERK1/2 抗体（CST，美国）、Nox1抗体（Abcam，美国）、Nox2/gp91phox抗体（武汉爱博泰克生物）、DRP1 抗体（CST，美国）、p-DRP1-S616抗体和p-DRP1-S637抗体（武汉爱博泰克生物）、环保组织固定液（北京雷根生物技术有限公司）。3.主要仪器 3.主要仪器 显 微 镜（Leica，德 国）、SDS-PAGE 电 泳槽（BIO-RAD，美国）、半干转膜仪（BIO-RAD，美国）。二、方 法1.小鼠模型构建1.小鼠模型构建将 30 只 C57BL/6J 小鼠用随机数表法分为 6组：Control组、3%DSS组、1%Dimethyl sulfoxide（DMSO）组、ERK1/2 抑 制 剂（PD98059）组、3%DSS+1%DMSO组、3%DSS+PD98059组，每组 5 只。Control 组和 3%DSS 组小鼠分别自由饮用双蒸水和含 3%DSS 的双蒸水 7 d。1%DMSO组和 PD98059 组小鼠自由饮用双蒸水 7 d，第16 日 1%DMSO 组小鼠给予腹腔注射 0.2 mL 的1%DMSO溶液，而PD98059组小鼠给予腹腔注射 10 mg/（kg d）PD98059溶液。3%DSS+1%DMSO组 和 3%DSS+PD98059 组 小 鼠 饮 用 含 3%DSS的 双 蒸 水 7 d，第 16 日 3%DSS+1%DMSO 组小 鼠 给 予 腹 腔 注 射 0.2 mL 的 1%DMSO 溶液，而 3%DSS+PD98059 组小鼠给予腹腔注射 10 mg/（kg d）PD98059溶液。在第7日处死小鼠。2.疾病活动指数评估2.疾病活动指数评估造模的第 1 日起，每日记录小鼠的体重、粪便性状和粪便潜血情况，计算小鼠疾病活动指histopathologicalscore.Theexpressionlevelsofp-ERK1/2，Nox1，Nox2incolonicmucosaofmiceweresignificantlyup-regulatedinthe3%DSSgroup（allP0.05）.Inmicewithcolitis，mitochondrialfissionincolonicepit