Smad1在鹅胚胎期皮肤毛囊的表达及分布规律分析_周宇轩.pdf

http:/Email:jlndxb 吉林农业大学学报 2023，45（1）：94-100Journal of Jilin Agricultural UniversitySmad1在鹅胚胎期皮肤毛囊的表达及分布规律分析*周宇轩1，李晟毅1，宋玉朴1，冯自强1，刘托娅1，林广宇3，孙永峰1，2*1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118；2.教育部动物生产及产品质量安全重点实验室，长春 130118；3.吉林省畜牧业信息中心，长春 130042摘 要：以豁眼鹅为研究对象，采用荧光定量PCR方法研究Smad1基因mRNA在鹅胚胎期13，18，28 d（E13、E18和E28）3个时间点表达趋势的变化；利用苏木精-伊红染色法（HE染色，Hematoxylin-eosin staining）结合免疫组织化学染色（IHC染色，Immunohistochemistry staining）对皮肤组织进行常规及特异性染色观察。荧光定量PCR结果显示，Smad1基因mRNA相对表达量在E13、E18、E28这3个时间点呈现下降趋势，其中E13与E18相对表达量差异显著（P0.05），E13与E28相对表达量差异极显著（P0.01），E13皮肤组织中Smad1基因mRNA相对表达量约为E28组织中表达量的3倍。HE染色和IHC染色结果显示，在E13的组织中，SMAD1主要分布于整个皮肤组织中，包括未分化的真皮与表皮以及真皮凝集体；至E18，SMAD1仍可见于皮肤及毛囊组织，但在毛囊底部呈现阴性状态；E28时，SMAD1阳性表达主要集中于表皮及毛囊周围，其他部位表达明显减少。结果表明：Smad1在鹅胚胎期毛囊发育分化过程中具有潜在的调控作用。关键词：Smad1基因；豁眼鹅；皮肤毛囊；表达规律；发育分化中图分类号：S835 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2023）01-0094-07DOI：10.13327/j.jjlau.2021.6097引用格式：周宇轩，李晟毅，宋玉朴，等.Smad1在鹅胚胎期皮肤毛囊的表达及分布规律分析 J.吉林农业大学学报，2023，45（1）：94-100.Expression and Distribution of Smad1 in the Embryonic Skin and Hair Follicles of Goose*ZHOU Yuxuan1，LI Shengyi1，SONG Yupu1，FENG Ziqiang1，LIU Tuoya1，LIN Guangyu3，SUN Yongfeng1，2*1.College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2.Key Laboratory of Animal Production and Product Quality Security of the Ministry of Education，Changchun 130118，China；3.Jilin Province Animal Husbandry Information Center，Changchun 130042，ChinaAbstract：Taking Huoyan goose as the research object,the fluorescence quantitative PCR method was used to study the expression trend of Smad1 gene mRNA on the 13th day(E13),18th day(E18)and 28th day(E28)of the embryonic stage of the goose;Hematoxylin-eosin staining(HE staining,Hematoxylin-eosinstaining),combined with immunohistochemical staining(IHC staining,Immunohistochemistry staining)was used for routine and specific staining of skin tissue.The results of fluores*基金项目：吉林省鹅种质资源与遗传改良创新团队项目（20200301035R），吉林省重点科技研发项目（20180201034NY），吉林省现代农业产业技术示范推广项目（吉牧202004），吉林省畜禽品种培育项目（2020051000001）作者简介：周宇轩，男，在读硕士，研究方向：家禽育种与分子遗传。收稿日期：2020-12-07*通信作者：孙永峰，E-mail：周宇轩，等：Smad1在鹅胚胎期皮肤毛囊的表达及分布规律分析吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural Universitycence quantitative PCR showed that the relative expression of Smad1 gene mRNA showed a downward trend at the three time points of E13,E18,and E28.The relative expression of E13 and E18 was significantly different(P0.05),and the relative expression of E13 and E28 is extremely significant(P0.01).The relative expression of Smad1 gene mRNA in E13 skin tissue is about 3 times that of E28 tissue.The results of HE staining and IHC staining showed that SMAD1 was mainly distributed in the whole skin tissues on the 13th day of embryonic stage,including undifferentiated dermis and epidermis,and dermal aggregates;until the 18th day of embryonic stage,SMAD1 was still found in the skin and hair follicle tissues,but showed a negative state at the bottom of the hair follicle.On the 28th day of embryonic stage,the positive expression of SMAD1 was mainly concentrated in the epidermis and hair follicles,and the expression in other parts was significantly reduced.The above experiments show that SMAD1 has a potential regulatory role in the development and differentiation of goose embryonic hair follicles.Key words：Smad1 gene；Huoyan goose；feather follicle of skin；expression pattern；development and differentation羽绒性状是鹅育种工作中重要的经济性状和遗传改良目标。鹅羽绒的产量及品质受品种、饲养周期及季节等因素的影响差异较大。然而，关于鹅羽绒产量与品质提升方面的育种研究工作突破甚微，传统的育种方式遗传进展表现缓慢，如果从分子水平初步探析鹅毛囊发育调控中潜在的关键基因，将为进一步从细胞水平及个体水平揭示鹅毛囊发育的调控机制奠定基础，有助于加快鹅羽绒性状分子育种工作的进展，为鹅业育种带来新希望。Smad1 基因属于 BMP 通路下游关键转录因子，其可传导典型 BMP 信号，如 BMP2、BMP4、BMP7 等1-2。BMP 信号在动物毛囊发生发育及周期性调控等各过程中起着至关重要的作用3-6，BMP2和BMP4被证实参与到毛囊静止期的维持中，并且 BMP 信号与 Wnt/-catenin 信号的周期性变化可能是毛囊周期产生的原因7。据报道，敲除 BMP 信号的受体可能会影响毛囊的数量8-9。因此，BMPs-Smads信号在毛囊发育中起着重要作用。此前，对鹅毛囊发生发育与BMP信号的关系的研究多集中在BMP信号分子上，但对于 Smad1基因的研究鲜有报道。本试验拟分析Smad1基因在豁眼鹅胚胎期13，18，28 d（E13、E18和E28）背部皮肤毛囊中的表达趋势及其蛋白的表达分布规律，为进一步探究BMP信号通路转录因子在鹅胚胎期皮肤毛囊发生发育中的作用机制奠定前期基础。1材料与方法1.1试验动物及样品采集试验动物由吉林农业大学鹅业研发中心种源基地提供，所有种蛋的蛋质量及蛋形指数均符合标准，种蛋是通过随机抽样的方式进行选取的。取豁眼鹅种蛋30枚放入孵化器中进行孵化（吉林农业大学鹅研中心），种蛋孵化采用变温孵化的方法，孵化条件：入孵 19 d温度设定为 38.1，湿度设定为60%65%，1016 d温度设定为37.8，并分别于 17，22 d按 0.3 的梯度下调温度，1028 d湿度均为55%60%。样品采集时间点为鹅胚胎期发育过程中较为重要的 3 个时间点即胚胎期 13，18，28 d（E13、E18、E28）。每个时间点取种蛋6枚，其中3枚种蛋用于RNA样品的制备，另外3枚用于组织切片的制备。于钝头处敲破鹅蛋并取出鹅胚胎置于无菌玻璃培养皿中，脱颈处死鹅胚后，取脱颈处死鹅胚背部皮肤约1 cm2，放入无菌PBS中漂洗并置于冻存管中，经液氮速冻后转移至-80 冰箱长期保存；将完整背部组织（包括骨骼、肌肉、皮肤等）取下，于PBS中漂洗，转移至4%多聚甲醛中固定备用。1.2主要试剂与仪器DEPC处理水、PBS、2PCR预混Mix、DAB显色试剂盒（生工生物工程股份有限公司），SMAD1抗体（北京博奥森生物技术有限公司），Triton X-100、牛血清白蛋白（BSA）、中性树胶封片剂（北95吉林农业大学学报 2023 年 2 月Journal of Jilin Agricultural University 2023，February京酷来搏科技有限公司），RNAiso Plus（TaKaRa公司），反转录试剂盒（ABP Biosciences公司），荧光定量 PCR 试剂盒（Thermo 公司），HE 染色液（北京欣华绿源科技有限公司），石蜡（Leica 公司），无水乙醇、二甲苯、氯仿、异丙醇（国药集团化学试剂有限公司）。孵化机（德州市顶峰机械设备有限公司），凝胶图像处理系统（北京鼎昊源科技有限公司），水平电泳仪、水平摇床（北京市六一仪器厂），PCR仪（杭州朗基科学仪器有限公司），低温高速离心机、组织切片机、荧光定量PCR 仪（Thermo 公司），超微量分光光度计（Bio-DL公司），显微镜及成像系统（OLYMPUS），手持式组织匀浆器及金属研磨杵（天根生化科技有限公司）。取样过程中所有的器械均经232 干热灭菌2 h 或 121 高 压 灭 菌 30 min，取 样 用 PBS 经0.22 m 针头式滤器过滤除菌，所有试剂均由超纯水配制。1.3RNA的提取及反转录1.3.1TRIzol法提取组织总RNA利用沉淀法（TR