澳洲坚果光壳种MiSAD的克隆与表达_杨倩.pdf

热带作物学报 2023,44(2):254-263 Chinese Journal of Tropical Crops 收稿日期 2022-05-10；修回日期 2022-06-27 基金项目 海南省自然科学基金项目（No.321QN300）；广东省自然科学基金项目（No.2021A151501242）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（No.1630062022002）。作者简介 杨 倩（1985），女，硕士，助理研究员，研究方向：作物资源与育种。*通信作者（Corresponding author）：曾 辉（ZENG Hui），E-mail：；杨子平（YANG Ziping），E-mail：。澳洲坚果光壳种 MiSAD 的克隆与表达 杨 倩1,2,3，杨子平1,2,3*，邹明宏1，宋喜梅1，万继锋1，陈 菁1，罗炼芳1，曾 辉1*1.中国热带农业科学院南亚热带作物研究所，广东湛江 524091；2.农业农村部热带果树生物学重点实验室，广东湛江 524091；3.海南省热带作物营养重点实验室，广东湛江 524091 摘 要：澳洲坚果果仁中含有丰富的不饱和脂肪酸（unsaturated fatty acid,UFA），其不饱和脂肪酸生物合成的分子机制还有待进一步解析。植物硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶（SAD）是脂肪酸生物合成途径中形成不饱和脂肪酸的关键酶。本研究以澳洲坚果（Macadamia integrifolia）光壳种为对象，通过 PCR 技术克隆获得澳洲坚果硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶基因（MiSAD），并对结构功能和表达模式进行了初步分析。结果显示，克隆获得 5923 bp 的 MiSAD 基因组 DNA序列，该基因由 3 个外显子 2 个内含子组成，包含 1191 bp 的编码框，与公布的粗壳种 MtSAD 序列高度一致；编码 396个氨基酸；MiSAD 分子量为 45.22 kDa，等电点为 5.93，属于酰基-ACP 脱饱和酶，是位于叶绿体或质体基质中的水溶性酶；高度保守的区域存在形成酶活位点的 2 个 E-X-X-H 二铁原子中心基序，N 端和 C 端氨基酸序列差异较大；二级结构中以-螺旋和无规则卷曲为主；三级结构预测中存在形成脂酰链结合部位的螺旋-转角-螺旋（HTH）；与蒂罗花的同源性最高达 94.2%，与其他物种的 SAD 同源性也都在 80%以上；分子进化树显示与荷花进化关系较近，属于植物脂酰-ACP 脱饱和酶。荧光定量 PCR 数据显示 MiSAD 在根、茎、叶、花、果中均有表达，其中叶片和果实中表达量较高，果实中的 MiSAD 表达量在开花后第 100 天左右达到最高，之后随着果实的成熟逐渐下降，呈现正态分布趋势。该研究为深入研究 MiSAD 在澳洲坚果果仁中不饱和脂肪酸生物合成的作用机制奠定基础。关键词：澳洲坚果；硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶；基因克隆；表达分析 中图分类号：S664.9 文献标识码：A Cloning and Expressing Analysis of Stearoyl-acyl-carrier-protein Desaturase(SAD)from Macadamia intergrifolia YANG Qian1,2,3,YANG Ziping1,2,3*,ZOU Minghong1,SONG Ximei1,WAN Jifeng1,CHEN Jing1,LUO Lianfang1,ZENG Hui1*1.South Subtropical Crops Research Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Zhanjiang,Guangdong 524091,China;2.Key Laboratory of Tropical Fruit Biology,Ministy of Agriculture and Rual Affairs Zhanjiang,Guangdong 524091,China;3.Key Laboratory of Tropical Crops Nutrition of Hainan Province,Zhanjiang,Guangdong 524091,China Abstract:Macadamia nuts contain abundant source of unsaturated fat acid(UFA),but the molecular mechanism of bio-synthesis of UFA remains to be further analyzed.Stearoyl acyl-carrier-protein desaturase catalyses the insertion of a double bond into saturated fatty acid bound in saturated acyl chains bound to ACP in higher plant,which is the key en-zyme in unsaturated fatty acid biological synthesis pathway.The Macadamia intergrifolia plant as research object,the full-length gDNA and cDNA of SAD gene encoding stearoyl acyl-carrier-protein desaturase were isolated from M.in-tegrifolia using PCR technique.The structure,function and expression pattern of MiSAD were preliminarily studied.The gDNA of SAD was 6947 bp and contained 3 exons and 2 introns.The open reading frame was 1191 bp and encoded 第 2 期 杨 倩等：澳洲坚果光壳种 MiSAD 的克隆与表达 255 396 amino acids which was highly consistent with the public MtSAD sequence,and SAD was a water soluble enzyme with a total predicted molecular mass of 45.22 kDa and isoelectric point(pI)5.93 located in chloroplast or plasmids stroma.The amino acid sequences of SAD involved in active site showed highly conserved and significant difference in N-end and C-end.The highly conserved region contained 2 central motifs of E-X-X-H iron atoms which formed the active site of this enzyme.The-helix and random curl were predominate in the secondary structure.The he-lix-turning-helix was found in the prediction of tertiary structure for formation of fatty acyl chain binding site.Derived amino acid sequence showed the highest homology 94.2%with Telopea speciosissima,and the homology is above 80%in other species of SAD,close to Nelumbo nucifera in phylogentic tree.The SAD gene expression trends were basically identical by qRT-PCR.The SAD expression were found in root,stem,leaf,flower and macadamia nut,and the highest level was in nut.The expression of SAD gene increased about 90days after and reached the highest level at 100 days,then declined gradually in the following days during the macadamia nut maturation and presenting a normal distribution trend.This study would build a foundation for elucidating the molecular mechanism of MiSAD in biosynthesis of un-saturated fatty acid in macadamia.Keywords:Macadamia integrifolia;stearoyl-acyl-carrier-protein desaturase(SAD);gene cloning;expressing analysis DOI:10.3969/j.issn.1000-2561.2023.02.004 澳洲坚果（M.integrifolia），又称夏威夷果，原产于澳大利亚，在热带和亚热带地区多有种植1，中国目前已经成为澳洲坚果种植面积最大的国家。澳洲坚果属于山龙眼科澳洲坚果属，主要有 4 个种，即 M.integrifolia Maiden&Betche、M.tetraphylla L.A.S.Johnson、M.ternifolia F.Mueller和 M.jansenii C.L.Gross&P.H.Weston，仅有光壳种（M.integrifolia）和粗壳种（M.tetraphylla）及其杂交种用于商业性栽培。澳洲坚果果仁不仅风味独特，而且具有很高的营养价值，含有丰富的脂肪酸、蛋白质、矿物质元素（锰、铁、镁）、维生素（B6）和微量元素2。研究表明，成熟的澳洲坚果中总油脂的含量最高可达 80.3%，主要包含油酸、棕榈油酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、二十碳烯酸、肉豆蔻酸和二十一烷酸等，其中油酸、棕榈油酸和二十碳烯酸是大含量脂肪酸，可以占到总脂肪酸的 87.52%3，澳洲坚果是重要的单不饱和脂肪酸来源植物，也是新兴的木本油料作物，但其遗传转化体系尚未建立，关于澳洲坚果果仁中不饱和脂肪酸生物合成和积累的分子机制研究鲜有报道。植物硬脂酰-酰基载体脱饱和酶（stearoyl acyl-carrier-protein desaturase,SAD）是质体中脂肪酸生物合成途径中的关键酶，能够催化硬脂酰-ACP 在第 9 位至第 10 位碳原子之间脱饱和形成双键4，是产生不饱和脂肪酸的关键步骤。因此，植物 SAD 酶是产生油酸和多不饱和脂肪酸的前提，大量研究表明，植物 SAD 基因能够显著调控植物中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例5-6。LIN 等7通过转录组测序技术发现澳洲坚果 SAD基因家族存在 12 个成员，GUMMESON 等8和RODRGUEZ 等9早期从澳洲坚果中分离到一个与不饱和脂肪酸生物合成相关的