HBV感染相关肝硬化患者外...粒体DNA的水平及临床意义_刘靓懿.pdf

61国际消化病杂志 2023 年 2 月第 43 卷第 1 期 Int J Dig Dis，February 25，2023，Vol.43，No.1 短篇论著 HBV 感染相关肝硬化患者外周血线粒体 DNA 的水平及临床意义刘靓懿 张 玲 胡 蓉 杨秀英 张忠文 宿冬远【摘要】目的 探讨 HBV 感染相关肝硬化患者外周血线粒体 DNA（mtDNA）的水平及临床意义。方法 随机选取 2021 年 1 月至 2021 年 6 月于崇州市人民医院接受治疗并符合纳入、排除标准的 45 例 HBV 感染患者和 45 例 HBV 感染相关肝硬化患者，分别设为 HBV 感染组和 HBV 感染相关肝硬化组，另选取 45 名同期于该院进行体检的健康志愿者作为健康对照组。构建人 mtDNA 及核单拷贝基因-globin质粒，采用 TaqMan 探针实时荧光定量 PCR 法测定外周血 mtDNA 水平，并分析其与 HBV 感染相关肝硬化患者临床特征的关系。入组的 HBV 感染相关肝硬化患者在测定基线数据后接受为期 12 个月的抗病毒治疗，之后根据病毒学应答情况分为预后良好组和预后不良组，采用 ROC 曲线分析外周血 mtDNA 水平对 HBV 感染相关肝硬化患者预后的预测价值。结果 与健康对照组比较，HBV 感染相关肝硬化组和 HBV 感染组患者外周血 mtDNA 水平均显著降低，且 HBV 感染相关肝硬化组显著低于 HBV 感染组，组间比较差异均有统计学意义（P 均0.05）。不同肝功能 Child-Pugh 分级、肝组织学纤维化分期及 HBV-DNA 载量的 HBV 感染相关肝硬化患者外周血 mtDNA 水平比较，差异均具有统计学意义（P 均0.05）。外周血mtDNA 水平与 HBV 感染相关肝硬化患者肝功能 Child-Pugh 分级、肝组织学纤维化分期及 HBV-DNA 载量均呈显著负相关（P 均0.05）。预后良好组外周血 mtDNA水平显著高于预后不良组（P0.05）。外周血 mtDNA 水平预测 HBV 感染相关肝硬化患者预后的敏感度、特异度及曲线下面积（AUC）分别为 67.29%、72.56%和 0.511。结论 HBV感染相关肝硬化患者外周血mtDNA水平下调，与肝功能Child-Pugh分级、肝组织学纤维化分期及 HBV-DNA 载量密切相关，且可能成为预后的预测指标。【关键词】HBV；肝硬化；线粒体 DNA；病情评估；预后DOI:10.3969/j.issn.1673-534X.2023.01.012作者单位：611230 崇州市人民医院消化内科通信作者：宿冬远，Email:线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，线粒体 DNA（mtDNA）是线粒体的遗传物质。由于mtDNA 缺乏组蛋白及 DNA 结合蛋白保护，并处于线粒体呼吸链氧化磷酸化的高活性氧环境，故其极易受活性氧（ROS）攻击1；而损伤的 mtDNA易累及重要功能区基因编码，并随着突变的不断累积参与多种疾病的发生2。研究表明，ROS 可能参与了肝纤维化的发生3。另有报道称，长期慢性HBV 感染可引起肝组织中大量 mtDNA 的 D-LOOP区碱基突变，且与早期肝癌的发生密切相关4。由此推测，mtDNA 可能在 HBV 感染相关肝硬化中起作用。因外周血样本相较于肝组织更容易获取，故本研究通过测定 HBV 感染患者和 HBV 感染相关肝硬化患者外周血 mtDNA 水平，探讨 mtDNA 与HBV 感染相关肝硬化发生、发展及患者预后的关系，旨在为临床提供更多的参考依据。1 资料与方法1.1 研究对象随机选取 2021 年 1 月至 2021 年 6 月于崇州市人民医院消化内科接受治疗并符合纳入、排除标准的 HBV 感染患者和 HBV 感染相关肝硬化患者，分别设为 HBV 感染组（n45）和 HBV 感染相关肝硬化组（n45）。纳入标准：（1）年龄3060岁；（2）62国际消化病杂志 2023 年 2 月第 43 卷第 1 期 Int J Dig Dis，February 25，2023，Vol.43，No.1慢性 HBV 感染诊断符合慢性乙型肝炎防治指南（2015 年版）5；（3）肝硬化诊断符合肝硬化诊治指南6，且由慢性乙肝发展而来；（4）无重叠甲肝病毒（HAV）、丙肝病毒（HCV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）等感染。排除标准：（1）其他类型病毒性肝炎、酒精性肝病、药物性肝病或代谢性肝病；（2）入组前已接受抗病毒等相关治疗，或近1 个月内有抗生素使用史；（3）合并心、肾、脑等重要脏器功能不全；（4）伴精神、意识、认知等障碍，无法配合完成研究；（5）合并自身免疫病、恶性肿瘤、高血压、糖尿病；（6）妊娠或哺乳期妇女；（7）出现肝硬化相关严重并发症。HBV 感染组中男性 26 例，女性 19 例，年龄 3048 岁，平均年龄为（38.894.53）岁。HBV 感染相关肝硬化组中男性 28 例，女性 17 例，年龄 3049 岁，平均年龄为（39.264.59）岁；根据肝功能 Child-Pugh 分级标准7，A 级 13 例，B 级 18 例，C 级 14 例；根据肝组织学纤维化分期标准5，S0 期 9 例，S1 期 10 例，S2 期 15 例，S3 期 6 例，S4 期 5 例；乙肝病毒 e 抗原（HBeAg）表达阴性 17 例，阳性 28 例。另选取同期于该院进行体检的 45 名健康志愿者作为健康对照组，其中男性 25 人，女性 20 人，年龄 3254 岁，平均年龄为（39.755.63）岁。3 组在性别、年龄方面的差异均无统计学意义（P 均0.05）。本研究经医院医学伦理委员会批准，并且入组对象均签署知情同意书。1.2 方法1.2.1 一般资料 收集受试者的性别、年龄、肝功能 Child-Pugh 分级、肝组织学纤维化分期、HBeAg表达等情况，采用实时荧光定量 PCR 法测定 HBV-DNA 载量。1.2.2 外周血 mtDNA 水平检测 采用 TaqMan 探针荧光定量 PCR 方法测定外周血 mtDNA 水平8。抽取所有受试者外周静脉血 2 mL，以 3 000 r/min 离心 15 min，分离血浆，-4 保存待用。采用磁珠法提取血浆基因组 DNA（试剂盒购自南京兔牙生物科技有限公司），使用 B-5000 超微量紫外可见分光光度计（购自上海凌仪生物科技有限公司）测定 DNA 含量，取质量浓度200 ng/L 样本进行后续实验。应用 Primer Premier 5.0 软件设计引物序列，通过 NADH 脱氢酶亚基 1（ND1）确定外周血mtDNA 含量，以核基因组-globin 作为内参基因8，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引 物 序 列 见 表 1，以 荧 光 基 团 FAM 和 猝 灭剂 TAMRA 分 别 标 记 探 针 的 5 端 和 3 端，ND1 TaqMan 探针 5-CCATCACCCTCTACATCACCGCCC-3，-globin TaqMan探针5-CCAGGCCATCACTAAAGGC ACCGA-3。PCR 反 应 体 系：200 mol/L 2Fast SYBR Green Master Mix 4 L，10 mol/L 上、下 游引物各 0.5 L，模板 DNA 1 L，使用无菌 ddH2O加至 8 L。反应条件：95 10 min 预变性，之后 95 16 s、60 60 s，进行 40 个循环；使用 Veriti 96 PCR 仪（购自美国 ABI 公司）检测荧光信号强度，绘制标准曲线和熔解曲线；取扩增产物进行 2%琼脂糖凝胶电泳，以验证 ND1 和-globin 的特异度，扩增片段长度分别为 122 bp、123 bp；实验结束后，根据各基因循环阈值（Ct）计算样本 mtDNA 拷贝数，mtDNA拷贝数2Ct；若样本中每个基因Ct0.5，则需重复实验。表 1 引物序列引物名称序列片段长度ND1正向：5-CCCTAAAACCCGCCACATCT-369 bp反向：5-GAGCGATGGTGAGAGCTAAG-3ND1 标准品正向：5-CAGCCGCTATTAAAGGTTCG-31 040 bp反向：5-AGAGTGCGTCATATGTTGTTC-3-globin正向：5-CTATGGGACGCTTGATGT-377 bp反向：5-GCAATCATTCGTCTGTTT-3-globin 标准品正向：5-CATCAAGCGTCCCATAGACTC-3410 bp反向：5-ACGTGGATGAAGTTGGTGGT-31.2.3 预后评估 参照慢性乙型肝炎防治指南（2015 年版）5对 HBV 感染相关肝硬化组患者进行抗病毒等治疗，为期 12 个月；将治疗 12 个月后病毒学部分或完全应答者纳入预后良好组，未获得病毒学应答者纳入预后不良组。1.3 统计学分析应用 SPSS 20.0 软件对数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数 标准差（xs）63国际消化病杂志 2023 年 2 月第 43 卷第 1 期 Int J Dig Dis，February 25，2023，Vol.43，No.1表示，2 组间比较采用独立样本 t 检验，组内比较采用配对样本 t 检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK-q 检验。计数资料以例（%）表示，采用 2检验。采用 Pearson 相关系数分析外周血 mtDNA 水平与 HBV 感染相关肝硬化患者临床特征的相关性。采用 ROC 曲线分析外周血mtDNA 水平对 HBV 感染相关肝硬化患者预后的预测价值。P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 3 组外周血 mtDNA 水平比较与健康对照组比较，HBV 感染相关肝硬化组和 HBV 感染组患者外周血 mtDNA 水平均显著降低，且 HBV 感染相关肝硬化组显著低于 HBV 感染组，差异均有统计学意义（P 均0.05）。见表 2。2.2 不同临床特征的 HBV 感染相关肝硬化患者外周血 mtDNA 水平比较肝功能 Child-Pugh 分级方面，C 级患者外周血mtDNA 水平低于 B 级，B 级低于 A 级，两两比较差异均具有统计学意义（P 均0.05）。肝组织学纤维化分期方面，S4 期患者外周血 mtDNA 水平低于其余各分期，且两两比较差异均具有统计学意义（P均0.05）。HBV-DNA 载量方面，1.0105 IU/mL者外周血mtDNA水平低于1.01031.0105 IU/mL 者，1.01031.0105 IU/mL 者低于1.0103 IU/mL者，两两比较差异均具有统计学意义（P 均0.05）。见表 3。表 2 3 组患者外周血 mtDNA 水平比较组别例数mtDNAHBV 感染相关肝硬化组45563.98191.42HBV 感染组45739.47186.51健康对照组45989.32221.47F 值51.197P 值0.0002.3 外周血 mtDNA 水平与 HBV 感染相关肝硬化患者临床特征的相关性分析外周血 mtDNA 水平与 HBV 感染相关肝硬化患者肝功能 Child-Pugh 分级、肝组织学纤维化分期及 HBV-DNA 载量均呈显著负相关（P 均0.05）。见表 4。表 3 不同临床特征的 HBV 感染相关肝硬化患者外周血 mtDNA 水平比较项目例数mtDNA统计值P 值肝功能 Child-Pugh 分级F44.3300.000 A 级13692.9525.34 B 级18653.2629.72 C 级14595.2825.35肝组织学纤维化分期F42.7060.000 S0 期9648.3425.38 S1 期10615.2023.62 S2 期15578.2726.29 S3 期6529.1923.61 S4 期5492.8524.63HBeAg 表达状态t1.9310.060 阳性17588.2826.39 阴性28573.2624.63HBV-DNA