miR-340-5p及PD...足细胞中的表达及生物学意义_丁广智.pdf

病 毒 学 报CHINESE JOURNAL OF VIROLOGYVol.39No.2March 2023第 39 卷 第 2 期 2 0 2 3 年 3 月miR3405p 及 PDCD4 在过表达乙肝病毒 X蛋白的足细胞中的表达及生物学意义丁广智，徐佳，刘畅，吴国志*（青岛大学 附属青岛市海慈医院，青岛 266033）摘要：乙肝病毒 X 蛋白（HBx）引起足细胞损伤与乙型肝炎相关性肾小球肾炎的发病有关，但具体的机制尚不清楚。miR3405p是受到 HBx调控的 miR，能够靶向细胞程序性死亡基因 4（PDCD4）基因发挥神经元保护作用。本研究观察了过表达 HBx的足细胞中 miR3405p及 PDCD4表达的变化及生物学意义。培养小鼠足细胞系 MPC5后转染HBx质粒、miR3405p、siPDCD4，MTS法检测细胞增殖活力 OD490、TUNEL 法检测细胞凋亡率、荧光定量 PCR 检测 miR3405p的表达、Western blot检测 PDCD4的表达、双荧光素酶报告基因实验验证 miR3405p靶向 PDCD4基因 3 UTR。结果显示，与对照组比较，HBx组细胞中 miR3405p的表达、OD490水平降低，PDCD4的表达、凋亡率增加；与 HBx组比较，HBx+miR3405p组细胞中 miR3405p的表达、OD490水平增加，PDCD4的表达、凋亡率降低，HBx+siPDCD4组细胞中 OD490水平增加，PDCD4的表达、凋亡率降低，miR3405p的表达无明显改变；PDCD4基因 3 UTR 中有 miR3405p的结合位点，miR3405p降低 PDCD4基因野生型 3 UTR 的荧光活力、不影响 PDCD4基因突变型 3 UTR的荧光活力。以上结果表明，过表达 HBx的足细胞中 miR3405p表达减少，进而可能通过增加PDCD4的表达引起足细胞损伤。本研究创新点为探究了 HBx引起足细胞损伤的分子机制，国内首次发现 miR3405p靶向 PDCD4在 HBx引起足细胞损伤中的作用，为今后研究 HBVGN的发病机制提供了参考。关键词：乙型肝炎相关性肾小球肾炎（HBVGN）；乙肝病毒 X蛋白（HBx）；足细胞；miR3405p；PDCD4中图分类号：R373.9 R373.2 文献标识码：A 文章编号：10008721（2023）02041908DOI：10.13242/ki.bingduxuebao.004272乙型肝炎相关性肾小球肾炎（Hepatitis B virus associated glomerulonephritis，HBVGN）由 乙 型 肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染引起，是临床常见的继发性肾小球肾炎1，2。我国是 HBVGN 的高 发 国，约 16%32%的 HBV 感 染 者 合 并 HBVGN3。近些年关于 HBVGN 发病机制的研究认为，HBV 感染引起足细胞损伤与肾小球滤过屏障功能的障碍、蛋白尿的发生密切相关。国内雷晓燕的研 究 发 现，乙 肝 病 毒 X 蛋 白（Hepatitis B virus X protein，HBx）能够使足细胞的增殖受抑制、凋亡增强4，提示 HBx可能在 HBVGN 的发病中起重要作用，但具体的机制尚不清楚。微小 RNA（microRNA，miR）是近些年心脑肾等疾病的研究热点，能够在转录后水平调控基因表达，进而在疾病的发生发展中起保护作用或损害作用。miR3405p 是一种具有保护作用的 miR，能够靶向凋亡基因细胞程序性死亡基因 4（Programmed cell death 4，PDCD4）减轻缺氧复氧引起的神经元损害、心肌损害57。肝癌相关的研究证实，HBx 调控肝癌细胞中 miR3405p 的表达8。但是，在 HBVGN 的发病过程中，HBx 是否调控 miR3405p 及下游凋亡基因 PDCD4 的表达、进而引起足细胞损伤未见报道。为此，本实验将以足细胞为实验对象，分析过表达 HBx对 miR3405p及 PDCD4表达的影响及生物学意义。材料与方法1 细胞系小鼠足细胞系 MPC5购自上海沪震生物科技有限公司，在液氮中保存。2 质粒空 白 的 pcDNA3.1 质 粒、过 表 达 HBx 的pcDNA3.1质粒均购自上海生工公司。3 miR、siRNA及抗体miR3405p序列（5TATGTCGAATGCTAGCC3）、siPDCD4 序列（5 ATCGTAGCTAGCAGTCG3）及阴性对照（NC）序列（5 TAGCTGATCGATGAGC3）均购 自 上 海 吉 玛 公 司。HBx 一 抗 购 自 BioVendor公司。收稿日期：20220511；接受日期：20220922作者简介：丁广智（1978），女，主治医师，从事中医肝病研究，Email：通讯作者：吴国志（1976），女，副主任医师，从事中医肝病研究，Email：开放科学（OSID）病 毒 学 报39卷4 试剂转 染 试 剂 Lipofectamine 2000 购 自 Thermo 公司，细胞增殖活力检测试剂盒（MTS 法）购自美国Pormega 公司，细胞凋亡检测试剂盒（TUNEL 法）购自上海碧云天公司，miR 快速提取试剂盒、miR 第一链合成试剂盒、miR 荧光定量 PCR 试剂盒购自北京天根公司，RIPA 裂解液、蛋白定量试剂盒（BCA法）购自北京普博欣生物公司，PDCD4 的一抗购自Abcam 公司。5 细胞培养及分组MPC5 细胞用含有 10%胎牛血清的培养基进行贴壁培养，细胞密度达 80%时用 0.25%胰蛋白酶进行消化传代，传代后的细胞接种在培养板内并分组。对照组转染空白 pcDNA3.1 质粒，HBx 组转染过表达 HBx的 pcDNA3.1质粒，HBx+NC组共转染过表达 HBx 的 pcDNA3.1 质粒及 NC 序列，HBx+miR3405p组共转染过表达 HBx的 pcDNA3.1质粒及 miR3405p序列。6 细胞增殖活力的检测MPC5细胞分组转染 24h，采用细胞增殖活力检测试剂盒（MTS法）进行实验，按试剂盒说明书操作后在酶标仪上检测 490nm波长的吸光值 OD490nm。7 细胞凋亡率的检测MPC5细胞分组转染 24h，采用细胞凋亡检测试剂盒（TUNEL 法）进行实验，按试剂盒说明书进行TUNEL染色及 DAPI染色，在显微镜下观察细胞阳性染色情况并计数，按照 TUNEL阳性染色细胞数/DAPI阳性染色细胞数计算凋亡率。8 miR3405p表达的检测MPC5细胞分组转染 24h，依次采用 miR快速提取试剂盒、miR 第一链合成试剂盒进行实验，按试剂盒说明书提取细胞中的 miR 并反转录为 cDNA，最后采用 miR 荧光定量 PCR 试剂盒配置 PCR 反应体系、对 cDNA 进行扩增反应，所用引物分别为 miR3405p及 U6的特异性引物，反应后生成循环曲线及循环阈值（Cycle threshold，Ct），以 U6 为内参、按照2Ct计算 miR3405p的表达水平。9 PDCD4表达的检测MPC5 细胞分组转染 24h，采用 RIPA 裂解液提取细胞中的蛋白，采用蛋白定量试剂盒（BCA 法）测定蛋白含量后，取 30g 蛋白样本进行 Western blot检测。将蛋白样本加入 SDS聚丙烯酰胺凝胶，电泳、电转 PVDF 膜、5%脱脂牛奶封闭后，4孵育 1：1 000 稀释的 PDCD4 一抗或 1：5 000 稀释的 actin一抗过夜；次日，室温孵育 1：2 000 稀释的二抗 1h，最后在凝胶成像系统中显影得到蛋白条带，以 actin 为内参、根据条带的灰度值计算 PDCD4 的表达水平。10 miR3405p靶向 PDCD4的生物信息学分析在 Targetscan 网站中输入 miR3405p，得到其靶基因的列表，在列表中查询 PDCD4 基因 mRNA 3 UTR中与 miR3405p互补配对的位点。11 miR3405p 靶向 PDCD4 基因的双荧光素酶报告基因实验设计含有 PDCD4 基因野生型 3 UTR 的双荧光素酶报告基因，将 Targetscan 预测的 miR3405p结合位点进行突变、得到突变型双荧光素酶报告基因，将双荧光素酶报告基因与 NC 序列或 miR3405p 序列共转染进入 MPC5 细胞，24h 后用双荧光素酶报告基因检测系统检测细胞中萤火虫荧光素酶的活力及海肾荧光素酶的活力，根据公式萤火虫荧光素酶的活力/海肾荧光素酶的活力计算荧光活力。12 统计学方法采用 SPSS20.0软件录入数据，多组间计量资料的比较采用单因素方差分析，有统计学差异的资料进一步采用 LSDt法进行两两比较，P0.05为差异有统计学意义。结 果1 MPC5 细 胞 中 HBx 质 粒、miR 340 5p、si PDCD4的转染效果与转染空白质粒的对照组比较，转染 HBx质粒的 HBx 组 MPC5 细胞中 HBx 的表达水平明显增加（P0.05）；与转染 NC 序列的 MPC5 细胞比较，转染 miR3405p 序列的 MPC5 细胞中 miR3405p 的表达水平明显增加，转染 siPDCD4 序列的 MPC5细 胞 中 PDCD4 表 达 水 平 明 显 减 少（P0.05）（图 1）。2 过 表 达 HBx 的 MPC5 细 胞 中 miR 340 5p、PDCD4表达的变化及 miR3405p、siPDCD4的干预作用与对照组比较，HBx 组 MPC5 细胞中 miR3405p 的表达水平明显减少，PDCD4 的表达水平明显增 加（P0.05）；与 HBx+NC 组比较，HBx+miR3405p 组 MPC5 细胞中 miR3405p 的表达水平明 4202期丁广智，等.miR3405p及 PDCD4在过表达乙肝病毒 X蛋白的足细胞中的表达及生物学意义显增加、PDCD4 的表达水平明显降低（P0.05）、PDCD4 的表达水平明显降低（P0.05）（图 2）。3 过表达 HBx 对 MPC5 细胞活力的影响及 miR3405p、siPDCD4的干预作用与对照组比较，HBx 组 MPC5 细胞活力 OD490nm水平明显降低（P0.05）；与 HBx+NC组比较，HBx+miR3405p组、HBx+siPDCD4组 MPC5细胞活力 OD490nm水平均明显增加（P0.05）（图 3）。4 过表达 HBx 对 MPC5 细胞凋亡的影响及 miR3405p、siPDCD4的干预作用与对照组比较，HBx 组 MPC5 细胞凋亡率明显增加（P0.05）；与 HBx+NC 组比较，HBx+miR3405p组、HBx+siPDCD4组 MPC5 细 胞 凋 亡 率 均 明 显 降 低（P0.05）（图 4）。图 25组 MPC5细胞中 miR3405p、PDCD4表达的比较注：与对照组比较，*P0.05；与 HBx+NC组比较，#P0.05Figure 2Comparison of miR3405p and PDCD4 expression in MPC5 cells among five groupsNotes：Compared with the control group，*P 0.05；compared with the HBx+NC group，#P 0.05图 1MPC5细胞中 HBx质粒、miR3405p、siPDCD4的转染效果注：与空白质粒组或阴性对照组比较，*P0.05Figure 1Transfection effects of the HBx plasmid，miR3405p，and siPDCD4 in MPC5 cellsNotes：Compared with blank plasmid group or negative control group，*P 0.05 421病 毒 学 报39卷5 miR3405p对 PDCD4基因