SMAD4基因在藏猪卵巢组织中的表达分析_边巴琼达.pdf

2023年 第53卷 第2期63试验研究藏猪是我国独有的高原高寒放牧型猪种，经野猪长期驯化而来1，是藏区农牧民主要的食物和经济来源之一。作为高原特色品种，藏猪兼具抗病抗寒力强、肉质细嫩香糯、低氧适应性佳等众多外来猪种与其他地方猪种不可比拟的优势1。受特定生态环境、社会经济与文化习俗等因素的影响，藏猪养殖基本保留了原始的饲养管理方式2，即在山坡、林间自由觅食，栖息、妊娠、产仔与哺乳等活动均在野外3。藏猪年产两胎，平均每胎产仔57头4。母猪发情后群体随机交配，不受人工选配干预4，因此母猪的繁殖性能受环境、品种、季节等因素的影响较大5，导致藏猪群体中收稿日期：2022-10-24基金项目：藏猪健康高效养殖的营养调控技术研究与示范（2020YFQ0029）；林芝山地沟口藏猪生态养殖模式研究与集成示范（2021-GX-SY-01）。作者简介：边巴琼达，畜牧师，主要从事动物遗传与育种研究。E-mail：通信作者：张健，博士，讲师，主要从事高原动物遗传资源保护与功能基因组研究。E-mail：长久存在近亲繁殖且繁殖性能低下等现象6。统计显示，外来品种长白猪平均每胎产仔1012头，大约克猪平均每胎产仔1013头7；国内本土猪种辽宁黑猪平均每胎产仔1114头，二花脸猪平均每胎产仔1215头8-9。相比之下，产仔数少，繁殖力低是藏猪最显著的繁殖特征。繁殖性状作为猪重要的经济性状，是反映生猪产业生产水平和经济效益的重要指标之一6，有效的群体繁育往往意味着更高的收益，繁殖活动的成败是养猪行业面临的一个至关重要的问题。随着先进育种技术的发展，动物品种选育经历了由传统的表型选育向分子标记辅助选SMAD4基因在藏猪卵巢组织中的表达分析边巴琼达1，孙雯莉2，索朗坚才2，赵舜旺2，巩兴龙2，张健2*（1.萨迦县扯休乡农牧综合服务中心，西藏萨迦857800；2.西藏农牧学院动物科学学院，西藏林芝860000）摘要：藏猪是我国青藏高原特有的珍贵品种，但因其繁殖能力低下，使得藏猪产业的发展受到严重阻碍，影响农牧民经济效益。为探究藏猪繁殖性状效应的基因分子机制，本文以藏猪及大约克猪的卵巢组织为研究对象，利用RT-qPCR技术从mRNA层面对调控藏猪繁殖性状的SMAD4基因的表达情况进行分析。结果表明，在卵巢组织中，藏猪SMAD4基因的表达量高于大约克猪，两者间差异极显著（P0.01），推测SMAD4基因可能是参与调节藏猪繁殖性能的重要功能基因。本研究可为下一步开展SMAD4基因对藏猪繁殖性能的影响提供参考依据。关键词：藏猪；卵巢；SMAD4基因；表达水平中图分类号：S813.1文献标识码：A文章编号：1006-799X（2023）02-0063-05DOI:10.15979/62-1064/s.2023.02.003642023年 第53卷 第2期育的快速发展过程。然而，迄今为止，对藏猪分子遗传育种的相关研究工作主要侧重于低氧适应性、抗病能力、脂肪沉积等方面，鲜少有关于藏猪繁殖性能的研究报道。藏猪品种特异的生殖系统分子调控机制亟待完善，有效的单个或多个候选基因分子标记稍显匮乏。因此，筛选藏猪繁殖相关的主效调控基因是提高藏猪繁殖性能、解决藏猪繁殖性能低下问题的关键前提，且加强对藏猪品种繁殖性能的遗传机制研究，是现下藏猪遗传育种工作的当务之急。SMAD4基因又名MADH4，被定位在1号染色体上。近些年研究发现转化生长因子（Transforminggrowthfactor-，TGF-）超家族可以调节动物细胞的增殖、分化、凋亡，影响动物的胚胎发育、器官形成以及细胞外基质合成和稳态，并且在胚胎原始生殖细胞形成、生殖细胞增殖分化等过程中发挥着重要的生理调控作用10。SMAD4蛋白作为TGF-信号核心蛋白，在TGF-信号通路中发挥着极其重要的作用11-12。越来越多的研究表明SMAD4基因与畜禽的繁殖性状密切相关。实 时 荧 光 定 量 P C R（R e a l-t i m eQuantitativePCR，RT-qPCR）是一种实用、准确的核酸定量分析技术，可灵活快速地对所测样品的目的基因与内参基因同时进行扩增以得到较为可靠的试验结果。本研究旨在通过RT-qPCR技术测定SMAD4基因在藏猪与大约克猪卵巢组织中的mRNA表达水平，并试论该基因对繁殖性状的调节作用。材料与方法1.1试验材料参试猪种中大约克猪（n=6）来自林芝市某养殖场，藏猪（n=6）来自西藏农牧学院动科学院实习牧场，参试猪均处于发情期，饲养模式相同。参试猪屠宰后立即进行剖腹手术取出卵巢，迅速置于液氮中冻存，并储存于-80冰箱内备用。1.2RNA提取本试验参照美吉生物总RNA提取试剂盒使用说明书提取藏猪和大约克猪卵巢组织中的总RNA，并使用1%琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计检测其完整性及浓度，用ddH2O稀释后，储存于-80冰箱内备用。1.3cDNA制备本试验按照诺唯赞生物HiScriptQRTSuperMixforqPCR反转录试剂盒说明书进行反转录，基因组DNA去除反应体系和反转录反应体系及程序如表1和表2所示。1.4RT-qPCR引物设计与合成登录NCBIGenBank（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载SMAD4基因与内参基因GAPDH的SusscrofamRNA序列，使用PrimerPremier3.0软件设计荧光定量PCR引物（表3）。以上引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。合成后用RNaseFreeddH2O按比例溶解，混匀后于4下保存。1.5RT-qPCR检测以cDNA为模板，GAPDH为内参基因，检测候选基因的mRNA相对表达量；每个样品组设置3个重复，RT-qPCR反应体系及程序如表4所示，相对表达量采用2-Ct的方法计算，公式如下：Ct（样品）=Ct（样品目的基因）Ct（样品内参基因）（1）Ct（标准样)=Ct（标准样目的基因）Ct（标准样内参基因）（2）Ct=Ct（样品)Ct（标准样）（3）目的基因表达量=2-Ct（4）反应试剂用量反应程序4gDNAwiperMix4L42，2minThetemplateRNA1 000ngupRNaseFreeddH2Oto16L反应试剂用量反应程序5qRTSuperMixII4L50，15min 80，2minreactionfluids16L表1去除基因组DNA反应体系表2逆转录反应体系试验研究2023年 第53卷 第2期651.6统计分析利用IBMSPSSStatistics23软件分析基因表达量的差异显著性，测定结果以P值（P-value）表示（P0.05时差异显著，P0.01时差异极显著，P0.05时差异不显著）。结果与分析2.1总RNA提取结果TotalRNA提取电泳结果如图1所示，28S、18S两条主条带清晰可见，条带明亮无污染。超微量分光光度计检测总RNA吸光值均在1.82.2之间。以上检测结果表明，所提取的总RNA完整性和浓度均满足后续反转录和定量要求。表3验证基因与内参基因引物信息表4候选基因RT-qPCR反应体系及程序基因名称GenBank登录号引物序列（53）产物长度（bp）SMAD4NM_214072F:ATTTCCCTTGCAACATTAGCR:GTGTACAATGCTCAGACAGG145GAPDHNM_001206359F:GGAGCGAGATCCCGCCAACAR:ACATGGGGGCATCGGCAGAA158反应试剂浓度用量（L）反应程序ChamQSYBRColorqPCRMasterMix105预变性：95，5min；变性：95，30s，退火：56，30s，延伸：72，40s（40个循环）；保存：4，Template(DNA)2.5mM4PrimerF10pM0.5PrimerR10pM1ddH2O012.2标准曲线结果目的基因SMAD4和内参GAPDH这两个基因的标准曲线分别见图2和图3。这两个基因的R2值0.99，且扩增效率均在1.82.3之间，每个基因标准曲线至少保留了3个浓度梯度。标准曲线结果可以说明，目的基因SMAD4和内参基因GAPDH引物的准确性和精确度可以满足后续荧光定量PCR试验要求。图1卵巢组织总RNA凝胶电泳图注：M泳道为Marker，14泳道为藏猪总RNA，58泳道为大约克猪总RNA。图3GAPDH基因的标准曲线图2SMAD4基因的标准曲线试验研究662023年 第53卷 第2期图4SMAD4基因在藏猪和大约克猪卵巢组织中的相对定量结果2.3RT-qPCR检测结果SMAD4基因的RT-qPCR检测结果如图4所示，SMAD4基因在藏猪卵巢组织中的表达量高于在大约克猪卵巢组织中的表达，两者间差异极显著（P0.01）。讨论与结论繁殖力是繁殖性能的主要方面之一。大多数的繁殖力性状属于数量性状，受部分主效基因与诸多微效基因的调控，这些调控繁殖性状的基因被称为繁殖力基因13。哺乳动物卵巢发育受诸多因素的影响，包括物种差异、外界环境、激素水平、基因表达水平与相关通路调节等14，这些因素影响着卵巢功能，也往往决定着繁殖性能的高低15。现有的相关研究中，Ding等16通过PCR-RFLP技术分析了15个繁殖性能不同的中外品种猪中PTGS2基因的遗传变异，发现在正调控繁殖性状的优势等位基因中，高原藏猪极显著低于江海型等繁殖力强的猪种。张浩等17发现，FSH、ESR和PRLR基因对藏猪群体的繁殖性状影响显著。应三成18采用PCR-RFLP技术检测了ESR基因在96头藏猪中的SNP，并分析出不同基因型与产仔数的关系。赵中权等19对88头四川藏猪的ESR基因数量性状基因座与高、低产仔数据进行联合分析，发现其优势等位基因与四川藏猪较高产仔数个体相吻合。关于SMAD4基因的研究，易凡利等20采用RT-qRCR技术验证了贵州香猪卵巢和子宫组织转录组所筛选的5个候选基因，发现处于发情期和发情间期的5个基因均呈显著性的组织表达差异。张月桥21探究了SMAD4基因在苏淮猪卵巢卵泡发育过程中的表达与定位，发现该基因主要在颗粒细胞中表达，随着卵泡的发育，表达也逐渐增强。SMAD4还是TGF-/Smad信号通路和BMP/Smad信号通路中唯一的共介导型基因22，在哺乳动物卵巢颗粒细胞中发挥着重要作用23。Wang等24研究发现，敲减猪卵泡颗粒细胞中的SMAD4基因后，颗粒细胞增殖受阻，凋亡增多；特异性敲除小鼠卵巢中SMAD4基因，小鼠表现出严重的卵丘细胞异常和颗粒细胞过早发生黄体化，并出现不育现象25。董蕾等26通过构建SMAD4过表达的人卵巢颗粒细胞（KGN）后发现，SMAD4过表达可明显抑制KGN增殖并促进凋亡。秦妍等27研究发现多囊卵巢综合征（PCOS）患者SMAD4的表达显著低于对照组，表明SMAD4可能会降低颗粒细胞（GC）的增殖潜能并导致细胞凋亡，从而导致滤泡性萎缩。以上研究表明，SMAD4基因与卵巢的正常发育密不可分。SMAD4基因功能在前人研究中均已表明与卵巢的发育密切相关，但是否因其在藏猪中的高表达造成繁殖性状的负调控变化，从而导致藏猪的繁殖性能下降仍有待探究。本试验结果显示，SMAD4基因在藏猪、大约克猪卵巢组织中的mRNA表达呈现极显著差异，SMAD4基因在藏猪卵巢组织中的mRNA表达水平极显著高于大约克猪。结合前人研究结果推测SMAD4基因是猪繁殖性状中重要的功能调节基因。本研究对SMAD4基因表达模式的分析，能够为进一步研究SMAD4基因对藏猪繁殖力的影响提供参考。参考文献1强巴央宗,谢庄,田发益.高原藏猪现状与保种策略J.中国畜牧杂志,2001(6):46-47.试验研究2023年 第53卷 第2期672邱丙姗,杨繁,周京伟,等.不同区域藏猪性能的比较研究J.猪业科学,2019,36(9):128-131.3王全喜,赵正月.藏香猪养殖问题及提高藏香猪经济效益的探析J.农家致富顾问,2016(14):1.4龚建军,吕学斌,李正确,等.藏猪繁殖性能研究J.西南农业学报,2009,22(3):807-810.5唐建华,冯静,陈晓英,等.藏猪种质资源保护与利用研究