UV-B胁迫提高斜纹夜蛾对绿僵菌的抗性研究_黄圆圆.pdf

接收日期：2022-11-02 接受日期：2022-12-02 基金项目：中国烟草总公司贵州省公司项目(2021XM09)；广州市科技计划项目(202206010042)；“十四五”广东省农业科技创新十大主攻方向柑橘黄龙病综合防控技术(2022SDZG06)；广东省现代农业产业技术体系创新团队建设专项(2022KJ108)*共同通信作者。E-mail:; UV-B 胁迫提高斜纹夜蛾对绿僵菌的抗性研究胁迫提高斜纹夜蛾对绿僵菌的抗性研究 黄圆圆1，王明慧1，何丽艳1，熊泽恩1，陈 洁1，Shaukat ALI1，孟建玉2*，桑 文1*(1.华南农业大学植物保护学院/生物防治教育部工程研究中心，广东 广州 510640；2.贵州省烟草科学研究院，贵州 贵阳 550081)摘 要：金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)是一种广谱的昆虫病原菌，可作为真菌杀虫剂防治多种害虫。绿僵菌与昆虫的相互作用十分复杂，诸多因素均可影响其侵染效果。本研究筛选出一株对斜纹夜蛾(Spodoptera litoptera)有较好杀虫效果的绿僵菌菌株，随后分析紫外线-B(UV-B)胁迫处理的斜纹夜蛾被真菌感染后的死亡率、血细胞数量、体内吞噬作用、血浆抗真菌活性等。结果表明，UV-B 前期照射能显著降低斜纹夜蛾幼虫被绿僵菌侵染的死亡率。UV-B 照射斜纹夜蛾幼虫 0.5 h 后用绿僵菌侵染处理 48 h，免疫反应相关的指标明显增加。说明昆虫对昆虫病原真菌的敏感性受紫外线胁迫的影响，紫外线能改变昆虫体内的免疫反应，促使昆虫抵御病原真菌的侵染。关键词：UV-B；绿僵菌；斜纹夜蛾；死亡率；免疫反应 Doi:10.3969/j.issn.1009-7791.2022.06.011 中图分类号：S476+.1 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2022)06-0497-08 UV-B Stress Increases Resistance of Spodoptera litura to Metarhizium anisopliae HUANG Yuan-yuan1,WANG Ming-hui1,HE Li-yan1,XIONG Ze-en1,CHEN Jie1,Shaukat ALI 1,MENG Jian-yu2*,SANG Wen1*(1.College of Plant Protection,South China Agricultural University/Engineering Research Center of Biological Control,Ministry of Education,Guangzhou 510640,Guangdong China;2.Guizhou Institute of Tobacco Science Research,Guiyang 550081,Guizhou China)Abstract:Metarhizium anisopliae is a broad spectrum insect pathogen,which can be used as a fungal insecticide to control various insect pests.The interaction between M.anisopliae and insects is very complex,and various factors may affect its infection effect.In this study,a strain of M.anisopliae with good insecticidal effect was obtained.The mortality,haemocyte number in haemolymph,phagocytosis and anti-fungal activity in plasma were analyzed in fungal infected Spodoptera litoptera after UV-B stress treatment.The results showed that within 4 to 8 h after treatment(UV-B stress for 0.5 h followed by infection with M.anisopliae),there was a significant increase in indicators related to the immune response.These results indicated that the sensitivity of insects to entomopathogenic fungi was affected by UV-B stress,and UV-B could change the immune response of insects,making them resistant to pathogenic fungi.Key words:UV-B;Metarhizium anisopliae;Spodoptera litura;mortality;immune response 斜纹夜蛾(Spodoptera litura)属于鳞翅目夜蛾科昆虫，在亚洲、欧洲及非洲均有分布，在我国主要 2022,51(6):497504.Subtropical Plant Science 第 51 卷 498分布于长江流域、南方各省以及黄河以北少部分地区。斜纹夜蛾能取食 109 科 389 种植物，包括葫芦科、蔷薇科、豆科、十字花科蔬菜以及柑橘(Citrus reticulata)等果树1。其初孵幼虫常聚集于叶背啃食，3 龄后分散取食植物叶片、嫩茎，也可取食花蕾、花，严重时可将整株植物全食。56 龄幼虫进入暴食期，其食量约占整个幼虫期的 90%以上2。斜纹夜蛾不但直接危害作物，其排泄物还可引起植株腐烂3。斜纹夜蛾重发区域的作物减产达 80%以上，甚至绝收4。目前，以氯虫苯甲酰胺、虫螨腈、茚虫威、甲维盐茚虫威、甲维盐虫螨腈等药剂为核心防治手段的化学防治是控制斜纹夜蛾的主要策略，但杀虫剂的长期大量使用会带来“3R”(病虫抗性、农药残留、病虫再猖獗)问题 58。昆虫病原真菌是一种被广泛使用的生物农药，专一性强，杀虫效果好，是害虫绿色防控技术的重要组成部分。绿僵菌(Metarhizium anisopliae)用 于 防 治 澳 洲 疫 蝗(Chortoicetes terminifera)9、云杉八齿小蠹(Ips typographus)10和黑豆蚜虫(Aphis craccivora)11，致死率均在 70%以上。绿僵菌同时被证实对夜蛾科害虫具有良好的防治效果12。莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)对草地贪夜 蛾(Spodoptera frugiperda)的 自 然 感 染 率 达29.83%，在室内条件下，用分离获得的 1108个mL1孢子悬浮液侵染草地贪夜蛾 3 龄幼虫，7 d 后幼虫死亡率可达 100%13。昆虫病原真菌资源丰富，具有寄主范围广、代谢类型复杂、生态友好、不易产生抗性、可扩散传播等诸多优点，但其田间应用效果易受环境影响，难以在防控虫害方面继续发挥优势1417。紫外线对微生物的杀伤主要通过使 DNA 分子产生嘧啶二聚体，进而使遗传物质失活，导致微生物失去繁殖能力或死亡18。研究表明，紫外光直接照射会导致附着昆虫体壁的昆虫病原真菌孢子萌发率降低，杀虫能力大为减弱1920。昆虫受到真菌侵染时，体内免疫系统被触发。昆虫主要依靠细胞免疫和体液免疫等先天免疫系统来抵御真菌感染21。细胞免疫中，昆虫血液循环系统中自由移动的血细胞构成昆虫免疫的第一道防线2223。血细胞通常会吞噬入侵血浆的微生物，并将其包裹控制24。美洲大蠊细胞接种绿僵菌后，血细胞通过吞噬作用形成结节使绿僵菌孢子钝化、不能萌发，或者彻底分解孢子25。体液免疫的机制多样化，如黑化反应、血淋巴凝固或抗菌肽的产生23,26。体液免疫往往依赖于特定的信号通路，比如果蝇受到真菌感染后被诱导合成抗真菌肽(Drosomycin)和碧蝽金属肽(Metchnikowin)等27。除了真菌侵染会引起昆虫的免疫反应，其他物理胁迫也会诱导昆虫的免疫反应2829。例如，紫外线-B(UV-B)胁迫诱导激活桃蚜(Myzus persicae)的抗原加工、呈递、趋化因子信号等30。那么，UV-B 能否通过提前激活免疫反应间接抑制昆虫病原真菌杀虫效果呢？本研究通过筛选出对斜纹夜蛾幼虫具有较高致病力的绿僵菌株系，测定 UV-B 照射对斜纹夜蛾幼虫抵抗绿僵菌致病力的影响，随后利用异硫氰酸荧光素(FITC)对绿僵菌进行荧光标记，分析紫外线胁迫下斜纹夜蛾血细胞数量、血细胞吞噬作用、血浆抗真菌活性变化，明确紫外辐射对昆虫抵御病原真菌侵染的间接效应，为绿僵菌田间应用提供理论依据。1 材料与方法 1.1 昆虫饲饲养 斜纹夜蛾从华南农业大学试验田的棉花上采集。按照 David 等31方法连续多代饲养于华南农业大学教育部生物防治工程研究中心。饲养温度(252)，相对湿度(805)%，光周期(L/D)16 h/8 h。1.2 虫生真菌培养和孢子悬液配制 金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)分离株SCHX46、SM036 和 ZB16 来自华南农业大学教育部生物防治工程研究中心虫生真菌种质资源库。将绿僵菌接种于PDA 平板上，在(262)下培养10 d 32。待菌株充分产孢后，用 0.01%Tween-80 去离子水溶液洗脱平板上的真菌分生孢子，用滤纸(Whatman No.2)筛选后装入无菌小瓶。用显微镜计数，配制1109分生孢子mL1绿僵菌孢子悬浮液，以此为原液，用含 0.01%Tween-80 去离子水连续稀释，制备较低浓度(1105、1106、1107和 1108分生孢第 6 期 黄圆圆等：UV-B 胁迫提高斜纹夜蛾对绿僵菌的抗性研究 499子mL1)分生孢子悬浮液17。1.3 斜纹夜蛾幼虫的绿僵菌处理 用饲喂法比较不同株系、不同浓度绿僵菌分生孢子悬浮液处理对斜纹夜蛾 4 龄幼虫死亡率的影响。在未凝固人工饲料中添加 5 种浓度(1105、1106、1107、1108和 1109分生孢子mL1)的各个绿僵菌分离株。以不添加真菌孢子为对照。将制备好的饲料冷却，置于 4 备用。将刚蜕皮的斜纹夜蛾 4 龄幼虫饥饿 3 h 后移入直径 4 cm 小塑料杯，分别投喂饲料 1 g。每处理设置 5 个生物学重复，每重复 30 头幼虫，每天更换新鲜饲料。统计处理 7 d后幼虫死亡率，选择致死率最好的绿僵菌分离株。利用所选的绿僵菌菌株孢子悬液注射法检测斜纹夜蛾 4 龄幼虫死亡率。按照 1.2 制备绿僵菌菌株分生孢子悬液(1103、1104和 1105分生孢子mL1)。将 4 龄斜纹夜蛾幼虫静置于冰上 5 min 使其休眠，然后用 75%乙醇擦拭虫体灭菌。对幼虫腹部进行注射孢子悬液以感染斜纹夜蛾。对照组注射等量的DPBS 溶液。1.4 UV-B 处理斜纹夜蛾幼虫 将 4 龄斜纹夜蛾幼虫置于 UV-B 荧光灯(光源波长的峰值在 303 nm，TL 20W/12 RS，东莞智臣电子有限公司，中国)下照射 0.5 h，以未照射 UV-B 的斜纹夜蛾幼虫作为对照。每天记录幼虫死亡率。每处理设置 3 个生物学重复，每重复 20 头幼虫。1.5 斜纹夜蛾幼虫血淋巴吞噬能力测定 采用异硫氰酸荧光素(FITC)对绿僵菌进行标记34。将 4 龄幼虫分为 2 组，每组 20 头幼虫。紫外线处理幼虫 0.5 h，对照组幼虫置于实验室条件下。幼虫孵育后先用 75%乙醇擦拭虫体灭菌，再用显微注射器从幼虫腹部气门处注射FITC标记的孢子悬液(1107分生孢子mL1)20 L。注射后对幼虫进行取血，并立即向血淋巴中加入