METTL14介导ERα的...控子宫内膜癌转移的机制研究_赵满英.pdf

250欢迎关注本刊公众号中国癌症杂志2023年第33卷第3期 CHINA ONCOLOGY 2023 Vol.33 No.3论 著METTL14介导ER的m6A修饰调控子宫内膜癌转移的机制研究赵满英1，伍东月2，杜瑞亭2，尹璐3，骆玉露11.青海省人民医院干部保健处，青海 西宁 810000；2.青海省人民医院妇科，青海 西宁 810000；3.青海省人民医院高压氧科，青海 西宁 810000摘要 背景与目的：甲基转移酶样因子14（methyltransferase-like factor 14，METTL14）失调引起的异常N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修饰在多种癌症的进展中发挥重要作用，目前尚不清楚其是否参与子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）的进展。本研究旨在探讨METTL14失调引起的异常m6A修饰在EC侵袭和转移中的作用。方法：收集96例20172021年在青海省人民医院接受治疗性手术的EC患者。从冷冻组织中分离RNA（70对）或蛋白质（10对），用于实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）或免疫印迹分析，以评估METTL14在EC中的表达。评估METTL14的表达及其与EC临床病理学特征的相关性。在体外和体内测定METTL14在EC中的生物学效应。将甲基化RNA免疫沉淀测序（methylated RNA immunoprecipitation sequencing，MeRIP-seq）与RNA测序（RNA sequencing，RNA-seq）相结合，并在m6A斑点印迹后，采用MeRIP-RTFQ-PCR、RIP-RTFQ-PCR或双荧光素酶报告基因分析来筛选和验证METTL14的候选靶标。结果：与匹配的相邻组织相比，EC中METTL14的mRNA表达和蛋白质水平显著下调。与METTL14高表达组相比，METTL14低表达组国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期、浸入深度、淋巴管血管侵犯、淋巴结转移及肿瘤转移例数显著增加（P0.05）。在功能上，METTL14在体外和体内抑制EC细胞的增殖和侵袭能力。从机制上讲，METTL14介导的m6A去甲基化导致雌激素受体（estrogen receptor alpha，ER）转录后抑制。此外，与METTL14相比，ER诱导肿瘤的致癌行为。结论：METTL14通过m6A依赖性方式在EC细胞中减弱ER的表达，进而抑制肿瘤转移和侵袭。关键词 甲基转移酶样因子14；N6-甲基腺苷；子宫内膜癌；雌激素受体中图分类号：R737.33 文献标志码：ADOI:10.19401/ki.1007-3639.2023.03.008Mechanism of METTL14-mediated ER m6A regulation of endometrial cancer metastasis ZHAO Manying1,WU Dongyue2,DU Ruiting2,YIN Lu3,LUO Yulu1(1.Department of Cadres Health Care,Qinghai Provincial Peoples Hospital,Xining 810000,Qinghai Province,China;2.Department of Gynecology,Qinghai Provincial Peoples Hospital,Xining 810000,Qinghai Province,China;3.Department of Hyperbaric Oxygen,Qinghai Provincial Peoples Hospital,Xining 810000,Qinghai Province,China)Correspondence to:LUO Yulu,E-mail:.Abstract Background and purpose:Aberrant N6-methyladenosine(m6A)modification caused by dysregulation of methyltransferase-like factor 14(METTL14)plays an important role in the progression of various cancers,and it is unclear whether it is involved in the endometrial cancer(EC)progression.This study aimed to investigate the role of aberrant m6A modification caused by dysregulation of METTL14 in EC invasion and metastasis.Methods:Ninety-six EC patients who underwent curative surgery in Qinghai Provincial Peoples Hospital from 2017 to 2021 were enrolled.RNA(70 pairs)or proteins(10 pairs)were isolated from frozen tissues for real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction(RTFQ-PCR)or immunoblot analysis to assess METTL14 expression in EC.The expression of METTL14 and its correlation with clinicopathological features of EC were assessed.基金项目：青海省卫生健康科研基金项目（2020-q-1271）。第一作者：赵满英（ORCID:0000-0002-3324-4859），本科，主治医师。通信作者：骆玉露（ORCID:0000-0002-4929-4906），本科，主任医师，E-mail:。251中国癌症杂志2023年第33卷第3期The biological effects of METTL14 in EC were determined in vitro and in vivo.Methylated RNA immunoprecipitation sequencing(MeRIP-seq)combined with RNA sequencing(RNA-seq),and following m6A dot blot,MeRIP-RTFQ-PCR,RIP-RTFQ-PCR or dual luciferase reporter assays were employed to screen and validate the candidate targets of METTL14.Results:The mRNA expression and protein levels of METTL14 were significantly downregulated in EC compared with matched adjacent tissues.Compared with the METTL14 high expression group,the METTL14 low expression group had a significant increase in International Federation of Gynecology and Obstetrics(FIGO)stage,infiltration depth,lymphovascular invasion,lymph node metastasis and the number of cases of tumor metastasis(P0.05).Functionally,METTL14 inhibited the proliferation and invasive capacity of EC cells in vitro and in vivo.Mechanistically,METTL14-mediated demethylation of m6A resulted in post-transcriptional repression of estrogen receptor alpha(ER).Furthermore,compared with METTL14,ER induced oncogenic behavior of tumors.Conclusion:METTL14 attenuates ER expression in EC cells in a m6A-dependent manner,thereby inhibiting tumor metastasis and invasion.Key words Methyltransferase-like factor 14;N6-methyladenosine;Endometrial cancer;Estrogen receptor alpha子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）是女性生殖道最常见的恶性肿瘤。被诊断患有晚期或复发性EC的女性患者预后较差，5年生存率仅为17%，这可能是由于这些女性对局部治疗的低反应 1。目前，放射治疗对晚期EC的疗效仍然存在争议，并且初始治疗后在疾病进展或复发时没有标准治疗选择 2。因此，需要更好地了解EC的分子特征，以改善患者的预后。N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）是哺乳动物mRNA中最常见的化学修饰 3。在细胞核中，mRNA上的m6A修饰受到动态调节，甲基转移酶样因子（methyltransferase-like factor，METTL）3/14等蛋白质通过形成甲基转移酶复合物催化特定RNA上m6A修饰的形成 4。最近研究 5-6发现，METTL14失调引起的异常m6A修饰在各种癌症的进展中起重要作用，例如，在结直肠癌和肝细胞癌中，METTL14已被报道通过调节m6A来抑制癌细胞转移。考虑到m6A RNA甲基化是mRNA最常见的修饰，我们假设METTL14也可能通过该方式调节特定mRNA来抑制EC的转移潜能。本研究旨在分析METTL14对EC侵袭和转移的调控作用，并基于m6A调控机制探讨肿瘤转移的分子机制。1 材料和方法1.1 患者样本收集96例20172021年在青海省人民医院接受治疗性手术的EC患者，采集肿瘤和邻近组织的标本，从冷冻组织中分离RNA（70对）或蛋白质（10对），用于实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）或免疫印迹分析，以评估METTL14在EC中的表达。1.2 细胞培养人EC细胞系AN3CA和KLE（美国典型培养物保藏中心）维持在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，美国Thermo Fisher Scientific公司）和1%链霉素/青霉素的DMEM（美国Hyclone公司）中，并置于37、CO2体积分数为5%的细胞培养箱中培养。实验1考察METTL14对EC细胞增殖、迁移和侵袭的影响。将AN3CA细胞分为METTL14敲低（si-METTL14）组和相应对照（si-NC）