DNA甲基化年龄推断及其在法医学中的应用展望_王紫薇.pdf

Journal of Forensic Medicine,February 2023,Vol.39,No.1DNA甲基化年龄推断及其在法医学中的应用展望王紫薇1，2，徐倩南1，3，李成涛1，刘希玲11.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 司法部司法鉴定重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063；2.苏州大学医学部法医学系，江苏 苏州 215123；3.四川大学华西基础医学与法医学院，四川 成都 610041摘要：随着DNA甲基化检测技术的发展，年龄相关甲基化修饰位点的研究发现了更多跨组织的年龄特异性位点，这使得个体年龄推断的灵敏度和准确性都有了提高。此外，各种统计模型的建立，也为不同来源组织的年龄推断提供了新的方向。本文从检测技术、年龄相关胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸位点和模型的选择等方面，对近年来DNA甲基化位点年龄推断的相关研究进行综述。关键词：法医遗传学；表观遗传学；DNA甲基化；年龄推断；综述中图分类号：DF795.2 文献标志码：A doi：10.12116/j.issn.1004-5619.2021.510604文章编号：1004-5619（2023）01-0072-11Age Estimation Based on DNA Methylation and Its Application Prospects in Forensic MedicineWANG Zi-wei1,2,XU Qian-nan1,3,LI Cheng-tao1,LIU Xi-ling11.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Shanghai Forensic Service Platform,Academy of Forensic Science,Shanghai 200063,China;2.Department of Forensic Medicine,Medical College of Soochow University,Suzhou 215123,Jiangsu Province,China;3.West China School of Basic Medical Sciences&Forensic Medicine,Sichuan University,Chengdu 610041,ChinaAbstract：With the improvement of DNA methylation detection techniques,studies on age-related methylation sites have found more age-specific ones across tissues,which improves the sensitivity and accuracy of age estimation.In addition,the establishment of various statistical models also provides a new direction for the age estimation of tissues from different sources.This review summarizes the related studies of age estimation based on DNA methylation from the aspects of detection technology,age-related cytosine phosphate guanine site and model selection in recent years.Keywords：forensic genetics;epigenetics;DNA methylation;age estimation;review表观遗传学是与遗传学相对应的概念，是指基于非基因序列改变所致基因表达水平的变化，包括DNA 甲基化、组蛋白修饰以及染色质重塑等。表观遗传修饰在个体发育衰老的过程中发挥着重要作用，其对个体组织和细胞的影响陪伴其终生1。相比组蛋白修饰和染色质重塑，DNA 甲基化所含信息量丰富且对 DNA 含量具有高敏感度，因而具有很高的法医学应用价值2。DNA 甲基化是通过 DNA 甲基转移酶将甲基基团添加到胞嘧啶环的 C-5位置对 DNA进行共价修饰，导致 DNA 构象变化，从而影响蛋白质与DNA 的相互作用，且甲基化程度与基因表达水平呈负相关。甲基化和去甲基化过程不仅对转录调控很 综述 基金项目：国家重点研发计划资助项目（2018YFC0807202）；国家自然科学基金资助项目（81871534）；中央级公益性科研院所资助项目（GY2021G-2）；司法部司法鉴定重点实验室资助项目；上海市法医学重点实验室资助项目（21DZ2270800）；上海市司法鉴定专业技术服务平台资助项目作者简介：王紫薇（1995），女，硕士研究生，主要从事法医遗传学研究；E-mail：通信作者：李成涛，男，研究员，博士研究生导师，主要从事法医遗传学研究；E-mail：通信作者：刘希玲，女，副研究员，硕士研究生导师，主要从事法医遗传学研究；E-mail：引用格式：王紫薇，徐倩南，李成涛，等.DNA甲基化年龄推断及其在法医学中的应用展望J.法医学杂志，2023，39（1）：72-82.To cite：WANG Z W，XU Q N，LI C T，et al.Age estimation based on DNA methylation and its application prospects in forensic medicineJ.Fayixue Zazhi，2023，39（1）：72-82.重要，在发育和细胞分化过程中也起着至关重要的作用，是造成个体表型差异的重要原因之一3-5。随着检测技术的提高，DNA 甲基化在法医学中的应用越来越广泛，有望作为法医学 DNA 序列相关遗传标记的有效补充，为司法鉴定或刑事侦查中个体年龄推断、组织体液来源鉴定等提供相关信息6-8。本文从DNA 甲基化角度出发，总结其用于年龄推断的研究进展，为进一步建立可用于法医学鉴定实践的年龄推断模型提供参考。1DNA甲基化与个体年龄的相关性1973 年，VANYUSHIN 等9以大鼠心、脑、脾、肺、肾等器官为研究对象对 DNA 中 GC含量和 5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-MeCyt）进行研究，首次报道了 DNA 甲基化整体水平随着年龄而变化，重点探讨了 DNA 中 5-MeCyt 含量的组织特异性，发现随年龄的增加 5-MeCyt的含量在大脑、心脏和脾中降低，而在肝、肺中没有改变，在肾中则有略微的增加。在同卵双胞胎之间开展的流行病研究也证实了表观遗传修饰在年长个体之间更容易出现差异9-12，由此提出了“表观遗传漂移（epigenetic drift）”假说。这一假说认为，随着细胞分裂，DNA 甲基化的保守性逐渐降低13。后续研究也表明，不同物种中多个胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸（cytosine phosphate guanine，CpG）位点的甲基化修饰程度与衰老过程显著相关，例如，一些抑癌基因和靶基因的甲基化程度随着年龄增长而增强14。最近 20 年间，随着芯片技术和高通量测序技术的飞速发展，有研究15-16检测了全基因组范围内DNA 甲基化的随龄变化特征，发现表观遗传改变是很多物种不同组织和细胞衰老过程中普遍发生的现象。值得关注的是，与年龄相关的 DNA 甲基化水平变 化 也 发 生 在 生 殖 细 胞 中，并 可 能 被 传 递 给 下一代17-18。2DNA甲基化检测技术2.1 检测技术分类按照 DNA 甲基化检测的原理，主要分为基于亚硫酸氢盐转换的方法、基于甲基化敏感性限制性内切酶（methylation sensitive restriction endonuclease，MSRE）的测序、基于亲和富集预处理的 DNA 甲基化检 测 技 术 和 基 于 单 分 子 测 序（single molecule sequencing，SMS）的第三代测序技术等19。亚硫酸氢盐测序是将化学修饰信息转换为序列差异信息，原始DNA经亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶（C）被转换为尿嘧啶（U），在之后的 PCR 过程中，尿嘧啶（U）被转换为胸腺嘧啶（T）后用于检测。目前大部分检测技术都以亚硫酸氢盐转换的前处理为基础，其转换效率很大程度上取决于原始DNA输入量。2014年，HOLMES等20采用 9种商业试剂盒对从血浆血清、福尔马林固定后石蜡包埋组织（formalin-fixed paraffin-embedding，FFPE）、尿 液 等 中 提 取 的DNA 进行亚硫酸氢盐转换的效能进行了比较，包含EpiTect Fast FFPE Bisulfite试剂盒、EpiTect Bisulfite试 剂 盒、EpiTect Fast DNA Bisulfite 试 剂 盒（德 国Qiagen 公司），EZ DNA Methylation-Gold 试剂盒、EZ DNA Methylation-Direct试剂盒、EZ DNA Methylation-Lightning 试剂盒（美国 Zymo Research 公司），innuCONVERT Bisulfite All-In-One 试剂盒、innuCONVERT Bisulfite Basic 试剂盒、innuCONVERT Bisulfite Body Fluids 试剂盒（德国 analytik jena 公司）。从转换效率上看，所有试剂盒均能达到 98.7%及以上，其中 EpiTect Bisulfite 试剂盒最低（98.7%），EZ DNA Methylation-Direct试剂盒最高（99.9%）。实验总耗时从 131 min（innuCONVERT 系列）到 402 min（EpiTect Bisulfite 试剂盒），其中对于人工操作时间而言，EZ DNA Methylation-Lightning试剂盒的最短，只需 66 min，而 EpiTect Fast FFPE Bisulfite试剂盒和EpiTect Fast DNA Bisulfite试剂盒最长，需要104 min。该研究还发现EZ DNA Methylation-Direct 试剂盒从未经预处理的FFPE组织中获得的DNA产率最低，而innuCONVERT Bisulfite All-In-One试剂盒所得DNA产率最高，且后者在所检的不同组织类型来源的样本中均有良好的表现。总体而言，亚硫酸氢盐转换步骤需要 50200 ng 初始 DNA 输入量以达到稳定的转换产率，否则将导致技术误差或者增大后续分析误差。MSRE法是利用MSRE对CpG位点进行切割的敏感性差异，将 DNA 消化为不同大小的片段后再进行检测。该方法无需碱基转换可直接对序列的甲基化状态进行分析，其受模板DNA完整性的影响较小，可用于石蜡包埋组织等的 DNA 甲基化状态的检测，其局限性在于该方法在一定程度上会受酶切步骤的完成程度影响，且只能分析 MSRE 识别序列中的 CpG位点。基于亲和富集预处理的 DNA甲基化检测技术主要有甲基化 DNA 免疫共沉淀（methylated DNA immunoprecipitation，MeDIP）技术和甲基化 CpG 结合域测序（methyl-CpG-binding domain sequencing，MBD-Seq）技术，常用于基因组范围内甲基化位点扫描。因为采用的富集蛋白不同，MeDIP倾向于富集CpG的低密度区域，而MBD-Seq倾向于富集CpG高密度区域。72法 医 学 杂 志 2023年 2月 第39卷 第1期重要，在发育和细胞分化过程中也起着至关重要的作用，是造成个体表型差异的重