IGF-2通过调控Treg...进小鼠结肠癌细胞移植瘤生长_周红见.pdf

免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.2023 论著 文章编号1000-8861（2023）03-0255-07；DOI10.13431/ki.immunol.j.20230033IGF-2通过调控Treg/Th17免疫平衡促进小鼠结肠癌细胞移植瘤生长周红见*，柯超，蒋斌，谢兴旺摘要 目的 探讨胰岛素样生长因子-2（IGF-2）对结肠癌荷瘤小鼠Treg免疫活性的影响。方法 将24只Balb/c小鼠左侧腋部皮下注射小鼠结肠癌细胞CT26制备结肠癌荷瘤小鼠模型，并随机分为对照组（生理盐水）和IGF-2低、中、高浓度组（25 g/kg、50 g/kg、100 g/kg IGF-2）。检测胸腺指数和脾脏指数，酶联免疫（ELISA）法检测血清IL-10、IL-18、TGF-1、IFN-水平，流式细胞仪检测血液Treg、Th17细胞比例，瘤组织称质量、计算小鼠促瘤率，TUNEL染色检测瘤组织细胞凋亡率，Westernblot法检测瘤组织中Ki67、Caspase-3蛋白表达。结果 与对照组相比，IGF-2低、中、高浓度组结肠癌荷瘤小鼠血清IL-10、TGF-1水平、血液Treg、Th17、Treg/Th17细胞比例、促瘤率及瘤组织中Ki67蛋白水平显著升高（P0.05），血清IL-18、IFN-水平、胸腺指数和脾脏指数及瘤组织细胞凋亡率、Caspase-3蛋白水平显著降低（P0.05）；随着IGF-2浓度的升高，结肠癌荷瘤小鼠血清IL-10、TGF-1水平、血液Treg、Th17、Treg/Th17细胞比例、促瘤率及瘤组织中Ki67蛋白水平逐渐升高（P0.05），血清IL-18、IFN-水平、胸腺指数和脾脏指数及瘤组织细胞凋亡率、Caspase-3蛋白水平逐渐降低（P0.05）。结论 IGF-2能发挥促癌作用，其机制可能与其能介导结肠癌荷瘤小鼠Treg/Th17细胞比例失衡，破坏机体免疫功能有关。关键词 胰岛素样生长因子-2；结肠癌；荷瘤小鼠；Treg/Th17中图分类号 R735.3文献标识码 AIGF-2 promotes the growth of mouse colon cancer xenografts byregulating Treg/Th17 immune balanceZHOU Hongjian*,KE Chao,JIANG Bin,XIE XingwangDepartment of Gastroenteroabdominal Wall and Hernia Surgery,Wuhan Third Hospital,Wuhan 430061,China*Corresponding Author:ZHOU Hongjian,E-mail:Abstract To investigate the effect of insulin-like growth factor-2(IGF-2)on Treg/Th17 immunobalance incolon cancer tumor-bearing mice,total of 24 Balb/c mice were injected mouse colon cancer cell CT26 on the leftaxillary subcutaneously to prepare colon cancer tumor-bearing mouse models,and then randomly divided intocontrol group(physiological saline),low IGF-2(25 g/kg),medium IGF-2(50 g/kg)and high IGF-2(100 g/kg)groups,with 6 mouse in each group.Thymus index and spleen index were calculated;the serum IL-10,IL-18,TGF-1,IFN-levels were detected by enzyme-linked immunoassay(ELISA);the proportion of Treg and Th17 cells inthe blood were detected by flow cytometry;the tumor tissue was weighed and the tumor promotion rate of mice wascalculated.Furthermore,TUNEL staining was used to detect the apoptosis rate of tumor tissue cells,while Westernblot method was used to detect the expression of Ki67 and Caspase-3 proteins in tumor tissues.Compared with thecontrol group,the serum IL-10 and TGF-1 levels,the proportion of Treg,Th17,Treg/Th17 cells in the blood,thetumor promotion rate and the tumor tissues Ki67 protein level were significantly increased in the IGF-2 low,medium and high concentration groups(P0.05),while the serum IL-18,IFN-levels,thymus index and spleenindex,tumor cell apoptosis rate,and Caspase-3 protein level were significantly reduced(P0.05).With the increaseof IGF-2 concentration,the serum IL-10 and TGF-1 levels,the proportion of Treg,Th17,Treg/Th17 cells in theblood,the tumor promotion rate and the tumor tissues Ki67 protein levels increased gradually(P0.05),and theserum IL-18,IFN-levels,thymus index and spleenindex,tumor cell apoptosis rate,and Caspase-3 proteinlevel reduced gradually(P0.05).In conclusion,IGF-2plays a role in promoting cancer,and the mechanism基金项目：汉市医学科研项目（WX20D26）作者单位：430061，武汉市第三医院胃肠腹壁与疝外科*通信作者：周红见，E-mail：255免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.2023结肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，发病率、死亡率均居癌症第3位，严重威胁人民生命健康1。研究发现，至少50%的结肠癌患者在进行肿瘤切除手术后出现复发和转移2。细胞免疫活性在肿瘤的形成、转移及复发过程中发挥重要作用，而手术及手术麻醉对机体的免疫系统具有抑制作用，这可能是肿瘤术后复发、转移的主要原因之一3-4。Treg/Th17是CD4+T细胞亚群中在分化与功能障相互制约的平衡体系，前者在抑制抗肿瘤免疫过程中发挥重要作用，后者是介导炎性反应的重要细胞群，该体系平衡打破导致的机体免疫失常在肿瘤发生中扮演重要角色5-6。胰岛素样生长因子-2（insulin-like growthfactor-2，IGF-2）是一种调节生长发育的多肽生长因子，近年来被发现与肿瘤的发生、发展关系密切，可作为多种肿瘤的预后标志物7-8；且阻断IGF2可抑制肿瘤的生长和转移，可能是癌症免疫治疗的潜在策略9-10。有研究发现，IGF-2在结直肠癌组织中高表达，与患者TMN分期关系密切，但其作用机制尚不明确11。本研究将探讨 IGF-2 对结肠癌荷瘤小鼠Treg/Th17细胞的影响，从免疫角度分析其在结肠癌中的作用。1材料与方法1.1实验细胞及动物小鼠结肠癌细胞 CT26（iCell-m014）购自赛百慷（上海）生物技术股份有限公司，用含1%青链霉素、10%胎牛血清的DMEM培养基常规培养、传代。SPF级雄性Balb/c小鼠，6周龄，体质量2024 g，购自河南斯克贝斯生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（豫）2020-0005，在温度24 左右、湿度50%左右、12 h昼/12 h夜交替照明环境中饲养，饮水、摄食自由。1.2主要试剂与仪器小鼠 IGF-2（QC-pb404mu02-r50ug）购自上海钦诚生物科技有限公司；DMEM培养基（PM150210）购自武汉益普生物科技有限公司；小鼠 IL-10、IL-18、TGF-1、IFN-酶联免疫（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（H-EL-IL-10、H-EL-IL-18、H-EL-TGF-1、H-EL-IFN-）购自上海泽叶生物科技有限公司；小鼠淋巴细胞分离液（BTN120914-EVD）、TUNEL 反应液（KFS197-KIM）购自北京百奥莱博科技有限公司；Ki67抗体（ab16667）、Caspase-3抗体（ab32351）、-actin抗体（ab8227）、羊抗兔IgG（ab6721）购自英国 Abcam；流 式 细 胞 仪（CytoFLEX）购 自 美 国Beckman coulter公司；光学显微镜（SMZ745）购自日本尼康公司。1.3结肠癌荷瘤小鼠制备取对数生长期CT26细胞，用无血清DMEM培养基稀释为1107/ml的单细胞悬液，用消毒后的注射器吸取 200 l，向每只Balb/c小鼠左侧腋部皮下注射制备结肠癌荷瘤小鼠，共制备24只，7 d后小鼠左侧腋部皮下接种处观察到明显的肿瘤结节即为结肠癌荷瘤小鼠制备成功。1.4实验分组、给药将制备成功的结肠癌荷瘤小鼠立即分为对照组和IGF-2低、中、高浓度组，每组6只，向IGF-2低、中、高浓度组小鼠分别尾静脉注射25 g/kg、50 g/kg、100 g/kg IGF-2，向对照组小鼠尾静脉注射等量生理盐水，隔天注射1次，给药10次结束。1.5ELISA法检测免疫因子表达水平末次给药次日，腹腔注射 4.0 ml/kg 10%水合氯醛将小鼠麻醉，仰卧位固定于手术台，常规备皮消毒后沿腹中线剪开腹腔，找到并固定腹主动脉，按压血管进针点上端，刺入穿刺针取血4 ml于预冷的试管内，分为2份。一份血液在4 以3 500 r/min离心10 min，分离上 层 血 清 并 使 用 IL-10、IL-18、TGF-1、IFN-ELISA试剂盒，严格按试剂盒说明书步骤进行操作测定血清IL-10、IL-18、TGF-1、IFN-水平。1.6流式细胞仪检测Treg、Th17细胞比例另一份血液加入淋巴细胞分离液、离心分离淋巴细胞，加入荧光标记抗体FITC-CD4抗体（Treg检测同时加APC-CD25抗体），在避光下孵育25 min，染色缓冲液洗涤并加1 ml透膜缓冲液重悬，4 避光下孵育40 min，再用1 ml透膜缓冲液洗涤、重悬2次，使用2 l正常大鼠血清封闭15 min，加入PE-FOXP3抗体或PE-IL-17抗体，4 避光下孵育30 min，洗涤，染色缓冲液重悬，用流式细胞仪测定Treg、Th17细胞含