NMHC_Ⅱ_A在前列腺癌...用及lncRNA调控轴筛选_杨玉轩.pdf

基金项目：吉林省财政厅资助项目（；）通讯作者文章编号：（）在前列腺癌转移中的作用及 调控轴筛选杨玉轩，刘斌，张杨贺，孟庆飞，王医术，周洪澜（吉林大学第一医院 泌尿外二科，吉林 长春 ；吉林大学 病理生物学教育部重点实验室，吉林 长春 ）摘要：目的研究 在前列腺癌转移中的作用并筛选其相关 调控轴。方法使用 数据库分析前列腺癌中 编码基因 的 表达水平。通过 检测良性前列腺增生细胞系 、前列腺癌细胞系 及其高转移型亚细胞系 中的蛋白表达水平。构建沉默的 细胞，筛选稳定感染细胞株，使用 及细胞免疫荧光染色鉴定沉默效果。检测法测定细胞增殖能力，迁移和侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力。语言筛选 数据库中前列腺癌转录组数据，得到异常表达的 和 并配对；、和 数据库在线预测靶向 的 ，比对在线预测结果与 数据库筛选结果，得到共有的 ，并根据 与 配对结果明确 上游的 ，进而推测 调控轴。结果 数据库分析显示，在前列腺癌组织中的表达高于正常前列腺组织（）。结果证明与 相比，在前列腺癌细胞 以及 细胞中表达增高（）。细胞的表达水平显著低于无感染组和空载组（）。细胞增殖能力显著低于无感染组和空载组（），迁移和侵袭能力也明显低于空载组与无感染组（）。数据库筛选结果显示，、和 轴可能在前列腺癌中发挥调节的作用。结论 可能通过靶向前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力调节前列腺癌的转移；、和 这条调控轴可能调控。关键词：前列腺癌；非肌细胞肌球蛋白重链；转移；恶性生物学行为中图分类号：文献标识码：，.（，）：，；，（），（）中国实验诊断学 年月第 卷第期 （），（），；，：；（，：）前列腺癌是最常见的男性恶性肿瘤之一。随着我国人民平均寿命延长及健康筛查普及，前列腺癌的发病率呈现持续增长趋势。前列腺癌易发生转移与复发，是导致患者死亡的主要原因。因此探寻前列腺癌转移机制具有重要意义。非肌细 胞 肌 球 蛋 白（）由 两 条 重 链（）、两条基本轻链（）和两条调节轻链（）组成。能够与肌动蛋白结合，通过自身磷酸化直接调控细胞运动。人包括三种 亚 型，分别为、以 及。由 基因编码，在机体的免疫应答、细胞的迁移、黏附及肿瘤转移等病理生理过程中发挥重要作用。然而目前并不清楚是否能够影响前列腺癌转移。长非编码（）是一类长度超过 单位核苷酸的非编码，主要通过表观遗传调控、转录调控、转录后调控、调控等在肿瘤的侵袭转移中发 挥 关 键 作 用。但 前 列 腺 癌 中 与之间是否存在调控作用尚不清楚。因此本 研究试图 探索 在 前列 腺癌中，是否存 在 能够调控，进而影响前列腺癌的转移。材料与方法 实验材料良性前列腺增生细胞系 由吉林大学第一医院泌尿系统疾病诊治中心提供，人前列腺癌细胞系 和 由吉林大学病理生物学教育部重点实验室提供。（编码基因）慢病毒载体及阴性对照慢病毒载体均购自上海吉凯基因 公 司。购 自 美 国 公司。试剂盒购自美国 公司。实验方法 数据库分析注册登录 数据库（：）。设定筛选条件：为 （）；为。细胞培养用含有 胎牛血清的 液体培养基，培养环境为、恒温孵箱。慢病毒感染取对数生长期细胞，以每孔 加入 感染增强液。根据复感染指数（）计算所需病毒体积，细胞感染 后加入 嘌呤霉素筛选直至无感染组细胞全部被杀死，将嘌呤霉素浓度降至维持浓度（），收集细胞进行鉴定，将鉴定结果满意的细胞更换不含嘌呤霉素的培养基培养扩增并冻存保种。提取样品总蛋白，使用 法测定样品蛋白浓度，根据所得样品蛋白浓度以及每孔道上样量需求，添加样品、蛋白上样缓冲液以及 并混匀，水浴 ，保存。常规蛋白凝胶电泳，恒压湿转法转膜。脱脂奶粉封闭后孵育一抗与二抗，进行 显色。细胞免疫荧光染色制备细胞爬片，进行细胞打孔，非免疫动物血清封闭细胞 ，一抗孵育过夜，荧光二抗室温孵育 ，室温孵育 ，甘油封片，荧光显微镜观察细胞并进行图像采集。应用 软件对各组细胞发出的荧光强度进行平均光密度（）分析测定。法绘制细胞生长曲线取对数生长期细胞接种于块 孔板，每组细胞设置个平行复孔，另外设置组仅加培养基不加细胞的空白组。接种细胞第天起，每天同一时间点随机抽取块 孔板，每孔加入 试剂，酶标仪测定 波长处吸光度值（）。迁移实验取对数生长期细胞，无血清 培养基重悬细胞，孔板内每孔加入 胎牛血清的 培养基，将 ，小室放入孔板内，无血清培养基的细胞悬液加入小室，常规培养。棉签擦去小室内未穿过基底膜的细胞，室温固定 。结晶紫染液室温染色 ，显微镜观察并采集图片。侵袭实验实验前一日，将 胶置于冰箱内融化。胶和无血清 培养基以的体积比混匀，取出小室放入 孔板内，移液器吸取 混合好的 胶注入小室内，恒温孵育 ，待胶凝固，再次使用移液器吸取 胶液体注入第一层胶上，恒温孵育 ，待胶凝固备用。细胞至对数生长期，使用无血清培养基重悬细胞，向 孔板每孔内 加 入 含 胎牛血清的 培养基，铺胶完毕的小室放于孔板内，每个小室内加入 无血清培养基的细胞悬液，常规培养。棉签擦去小室内基质胶及未穿过基底膜的细胞，室温固定 。结晶紫室温染色 ，显微镜观察并采集图片。语言筛选及数据库比对（）安装 及 软件。下载 数据库前列腺癌转录组数据的基因表达与 表达数据集。对 与 表达数据集进行差异分析，得到正常组织与癌组织中差异表达的 与 。数 据 库 下 载 文件，筛选出与目前已知 存在结合位点的差异表达 以及筛选所得 所对应的全部 ，得到差异表达 配 对 关 系 文 件。使 用 软件与 配对关系文件，绘制 对应关系网络图。（）使用 、和 在线数据库对与 基因存在结合位点的 进行预测，对比选出个数据库共有的 ，与已得到的 配对关系文件进行比对，筛选出在前列腺癌中差异表达、能够与差异 配对且与 基因存在结合位点的 。统计分析实验数据使用 进行统计分析，以均数标准差（）表示，采用检验、单因素方差分析及重复测量方差分析，表示差异具有统计学意义。结果 在前列腺癌中的表达情况在设定的筛选条件下，共有 项独立研究涉及 在不同类型肿瘤与正常组织间的表达情况比较，其中 项研究显示 表达在肿瘤与正常组织间存在统计学差异（）（图）。进一步分析发现在 数据集中，在前列腺癌组织中的表达高于正常前列腺组织（）（图）。结果显示：与前列腺癌细胞 、相 比，良 性 前 列 腺 增 生 细 胞 中 表达水平较低，差别具有统计学意义（）；与前列腺癌细胞 相比，前列腺癌细胞 中 表达较低，差别具有统计学意义（）（图）。鉴定稳定转染细胞株中 的沉默效果 检测各组细胞中 的表达情况，结果显示：无感染组与空载组间 的表达水平无明显差异（）；细胞表达水平显著降低（为内参蛋白，）（图）。细胞免疫荧光结果显示：无感染组与空载组间细胞 内 阳 性 表 达 区域 值 无 显 著 差 异（）；与无感染组及空载组相比，细胞内阳性表达 区 域 值 显 著 降 低（）（图）。沉默 对前列腺癌细胞 增殖能力的影响 检测结果显示：细胞进入对数生长期后，空载组、无感染组两组细胞的增殖能力无明显差异（），而 细胞增殖能力显著低于无感染 组 和 空 载 组，差 别 具 有 统 计 学 意 义（）（图）。沉默 对前列腺癌细胞 迁移能力的影响 迁移实验测定各组细胞迁移能力，结果显示：无感染组穿过基底膜的细胞数为（）个，空载组穿过基底膜的细胞数为（）个，两 组 间 无 统 计 学 差 异（）；细胞穿膜细胞数为（）个，显著少于无感染组和空载组，差异具有统计学意义（）（图）。沉默 对前列腺癌细胞 侵袭能力的影响 侵袭实验测定细胞侵袭能力的改变，结果显示：无感染组降解 胶穿过基底膜的细胞数为（）个，空载组为（中国实验诊断学 年月第 卷第期 ）个，两 组 间 没 有 统 计 学 差 异（）；细胞穿膜细胞数为（）个，显著少于无感染组和空载组，差异具有统计学意义（）（图）。图 在前列腺癌中的表达 数据库分析不同类型肿瘤与正常组织间 的表达情况，红色表示表达上调，蓝色表示表达下调；数据集中 表达情况；检测 、及 细胞中表达水平。图检测稳定感染细胞株中 的沉默效果 检测各组细胞的表达情况；细胞免疫荧光染色检测各组细胞的沉默效果。，.；标尺，图 法检测沉默 对前列腺癌细胞 增殖能力的影响 ，。筛选前列腺癌中与 相关 调控轴利用 语言筛选 数据库中前列腺癌转录组数 据 集 中 正 常 组 织 与 癌 组 织 中 差 异 表 达 的 、并进行配对。结果显示：与正常组织相比，前列腺癌组织中差异表达的 共有 个（图）；差异表达的 共有 个（图）。将二者具有潜在结合能力的 与 绘制对应关系网络图（图）。在 、和 数据库中预测与 基因存在结合位点的 ，将所得 与 图 迁移实验检测沉默 对前列腺癌细胞 迁移能力的影响 ，；标尺。图 侵袭实验测定沉默 对前列腺癌细胞 侵袭能力的影响 ，；标尺。进行对比。结果显示：是个数据库中共有的具备 结合位点的 之一（图），同时 （表达下调）也在 对应关系网络中，可与 配对的 为：（表达上调）、（表达下调）、（表达下调）、（表达上调）以及 （表达上调）。由此推测，和 轴可能在前列腺癌中发挥调控 的作用。讨论前列腺癌是常见的男性恶性肿瘤，发病率位列男性 恶 性 肿 瘤 第 二 位，对 男 性 健 康 构 成 严 重 威胁，。前列腺癌易发生转移，是患者死亡的主要原因之一。因此，探寻前列腺癌转移的分子机制对于前列腺癌的防治具有重大意义。由 基因编码，是细胞骨架的构成组分之一，参与细胞黏附、细胞运动及细胞分泌等多种生物学行为。是一类长度超过 个单位核苷酸的非编码 ，它们能够通过转录、转录后及染色质修饰等多种方式发挥调控作用 。在肿瘤的转移中，亦发挥重要作用。及其组成成分 能够在多种组织器官中表达，并且在多种肿瘤中异常表达。等 在胃癌研究中发现，在癌组织中的表达水平显著高于正常癌旁组织。同样，表达水平在大肠癌组织中也异常升高。熊丹 等应用 检测了正常膀胱组织原代培养细中国实验诊断学 年月第 卷第期图筛选前列腺癌中与 相关 调控轴 数据库中前列腺癌患者差异表达 ；数据库中前列腺癌患者差异表达 ；前列腺癌患者中差异表达 与 的对应关系网络图（矩形表示 ，椭圆形表示 ，红色表示在前列腺癌患者中表达上调的 与 ，蓝色表示在前列腺癌患者中表达下调的 与 ）；在 、公开数据库中共有的具备 结合位点的 ：。胞株 及膀胱癌细胞株 、和 中的 表达水平，发现三种膀胱癌细胞株中 的 水平显著升高，且高转移细胞株 中的 表达水平显著高于低转移膀胱癌细胞株 。本研究中，使用 数据库分析编码基因 在前列腺癌中的表达情况，结果显示，在 数据集中，在前列腺癌组织中的表达高于正常前列腺组织（）。随后应用 检 测 良 性 前 列 腺 增 生 细 胞 系 、前列腺癌细胞系 和 高转移亚细胞系 中蛋白的表达情况，结果显示，蛋白在 、和 细胞中均有表达，但相比于良性前列腺增生细胞 ，蛋白在前列腺癌细胞 和 细胞中的表达显著升高（）；并且发现，相比于 细胞，细胞中 蛋白表达水平更高（）。提示 蛋白的表达水平随着前列腺癌细胞转移能力的增强而升高。从而推测，表达升高可能与前列腺癌转移有关。正常细胞的增殖受到多方面的协同调控，而恶性肿瘤细胞能够不受机体调控，发生无限的分裂、增殖，这 是 恶 性 肿 瘤 细 胞 的 主 要 特 征 之 一。等 报道，炎症因子可以通过 诱导 表达，依 赖 其 表 皮 生 长 因 子 结 构 域 与相互作用，从而形成、和 之间的反馈环，进一步激活 并抑制胃癌细胞中 信号通路，最终抑制胃癌细胞增殖。在低表达的大肠癌细胞 中，转入外源性 基因并表达，发现细胞增殖能力有所增强；在高表达的大肠癌细胞 中沉默 基因可以抑制癌细胞增殖，提示 可以促进大肠癌细胞的增殖。本研究采用 试剂盒检测细胞增殖能力，与无感染组 和 空 载 组 细 胞 相 比，沉 默的 组细胞在进入对数生长期后，增殖速度显著降低（），提示 参与调控细胞的增殖，沉默能够显著抑制前列腺癌细胞 增殖，但具体调控机制有待进一步研究。肿瘤细胞发生迁移和侵袭，二者相互协同并促使肿瘤细胞发生远处转移。在肿瘤细胞发生远处转移的初