miR-124通过靶向ST...3表达抑制食管癌的机制研究_王元锦.pdf

第 卷 第 期 年 月川北医学院学报（：.）.，.：.基础研究基金项目：江苏省卫生健康委员会科研项目（）作者简介：王元锦（），男，硕士，主治医师。：通讯作者：张昊。：通过靶向 表达抑制食管癌的机制研究王元锦，张昊（徐州医科大学徐州临床学院，江苏 徐州；徐州市肿瘤医院心胸外科，江苏 徐州）【摘要】目的：探讨 通过靶向转录激活因子（）表达抑制食管癌的机制。方法：将培养转染后 细胞分为 组、组、组、组、组、组、组、组，未转染 细胞为对照组，每组细胞各 株。采用流式细胞术、法、免疫印迹（）、小室实验分别检验各组细胞的凋亡率、细胞增殖及、淋巴细胞瘤因子 （）、相关 蛋白（）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（）的表达量及细胞迁移及侵袭能力；双荧光素报告基因检测验证 与 的靶向关系。结果：与人正常食管上皮细胞相比，食管癌、细胞中 表达下调（.），及蛋白表达升高（.）；过表达 可抑制癌细胞活力、迁移及侵袭能力（.），上调细胞凋亡相关蛋白表达（.），并靶向抑制 的表达（.）；过表达 可部分逆转 作用（.），促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭（.），抑制癌细胞凋亡（.）。结论：可靶向调控 的表达，进而抑制食管癌细胞的增殖、迁移、侵袭及促进食管癌细胞凋亡。【关键词】食管癌；转录激活因子；分子机制；靶基因【中图分类号】；【文献标志码】，（，；，）【】：，：，（），（），（），：，（.），（.），（.）：，【】；食管癌病因复杂，与日常饮食及生活方式息息相关，发病率和死亡率在世界范围内稳步上升，且缺乏国际公认的标准防治方案。近年来大量研究报道（）在基因表达调控中的影响，尤其对肿瘤细胞的调控作用受到学者的广泛关注。研究表明，与食管鳞状细胞癌的发生及进展相关，通过上调基因 的 多态性，可降低老年人食管癌的患病 第 卷 第 期 年 月 川北医学院学报（：.）.，.风险，抑制肿瘤增长，但对食管癌细胞的作用靶点研究尚不完善。信号转导和转录激活因子（，）可通过靶向多种基因参与细胞增殖、凋亡等多种生理过程。相关研究证实，食管癌细胞中 被激活后可通过上调，促进食管上皮细胞内肿瘤的形成。据此推测 可能对食管癌肿瘤具有抑制作用，而 可能参与介导该过程。本研究旨在通过探讨 与 的靶向关系，分析 对食管癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响。材料与方法 材料杜氏细胞培养基（）、减血清培养基（公司）；、（公司）；试剂盒（日本 公司）；试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，）；膜联蛋白 异硫氰酸荧光素碘化丙啶（）凋亡检测试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司）；质粒载体（上海康朗生物科技有限公司）；双荧光素酶报告基因、表达检测试剂盒（上海碧云天研究所）；淋巴细胞瘤因子（）、相关 蛋白（）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 （）的第一抗体（公司）。方法 细胞培养、转染及分组 在 、体积分数为 的培养培中，采用含 胎牛血清的 培养人食管癌细胞、和人食管黏膜上皮细胞。取对数生长期 细胞，待细胞生长至 融合度时将培养基更换为 减血清培养 基，参 照 转染试剂转染至 细胞，并依据转染剂不同分为 组、组、组、组、组、组、组及 组；未经转染的 细胞设为对照组，每组细胞各 株。检测细胞中、表达量 收集、细胞及转染后的各组 细胞，采用 法提取上述细胞中的总，检验 浓度及纯度；依据试剂盒说明逆转录合成，反应体系 （，），轻柔混匀后加入 扩增仪中，反应条件为：反转录，反转录酶失活后，保存。采用 试剂盒对 中的、进 行 荧 光 定 量，反 应 体 系（）：（）、正反向引物（）各.、（）.、灭菌蒸馏水。反应条件：，共 次循环。以 或 为内参，以计算、的表达量。见表。表 引物序列基因序列（）产物长度（）：（）检测各组 细胞中、的相对表达量收集各组 细胞，加入 蛋白裂解使其充分裂解后，提取细胞中的总蛋白；将蛋白质置于在 沸水中变性，取上清液进行蛋白电泳上样；采用转膜仪将上样蛋白转移到 膜上，转膜完成后用 脱脂牛奶封闭处理 ，而后在一抗（包括、）溶液中以 处理过夜；次日取膜洗净后置于二抗溶液中，孵育；最后在凝胶仪中曝光得到蛋白条带。采用 图像软件分析各蛋白条带的灰度值。以 为内参，目标蛋白与 条带灰度值的比值表示目标蛋白的相对表达水平。检测细胞增殖 细胞.个 接种在 孔板，孔；加 溶液，连续培养 ，结束后弃上清，加入 孔，检测各孔 值。流式细胞术检测细胞凋亡率收集各组 细胞，将细胞接种在 孔板内，严格按照 凋亡试剂盒说明书操作，加入缓冲液重悬细胞、加入 及 避光孵与 ，结束后置于流式细胞仪检测细胞凋亡情况。凋亡率（）早期凋亡（）晚期凋亡（）实验测定细胞迁移及侵袭细胞王元锦，等 通过靶向 表达抑制食管癌的机制研究迁移实验：稀释液包被 小室底部膜的上室内，风干。吸取培养板中残液，每孔加入 含 的无血清培养液，。细胞撤血清饥饿 ；消化细胞终止后离心弃去培养液，冲洗 遍后用 无血清培养基重悬，调整细胞密度至 。取上述各组细胞混悬液 加入 下层小室，常规培养 。去除小室上层液体，棉签轻拭去剩余 胶及未穿膜细胞，将碳酸酯膜从室基切下，苏木素染色后，在光学显微镜下观测穿膜细胞数，随机取 个视野拍照并计数每个视野下，穿出膜的细胞数，取其均值纳入统计。细胞侵袭实验：小室上室使用稀释的 基质胶（），包被 。后续按照 细胞迁移测定的步骤检测侵袭细胞数。双荧光素酶报告基因检测 与 的靶向关系 预测 与 之间的结合位点，将 （含 片段）和 （含 片段突变体）克隆至 载体荧光素酶后的区域，建立荧光素酶报告质粒。再将已载入基因片段的 与脂质体混合分别与、共同转染至 细胞。严格遵从双荧光素酶报告基因测试试剂盒说明书操作，最终结果以海参荧光素酶荧光强度与萤火虫荧光素酶荧光强度比值为细胞荧光活性。统计学分析采用 软件对数据进行分析与处理。计量资料以（）表示，组间采用成组 检验，多组间采用方差分析；计数资料以（）表示，组间采用 检验。.为差异统计学意义。结果 正常食管上皮细胞和食管癌细胞中、及 蛋白表达比较 检验发现，与人正常食管上皮细胞相比，食管癌、细胞中 表达下调（.），及蛋白高表达（.）。见图。图1正常食管上皮细胞和食管癌细胞中miR-124、STAT3 mRNA及STAT3蛋白表达比较A.正常食管上皮细胞和食管癌细胞中miR-124、STAT3 mRNA表达；B.食管细胞中STAT3蛋白表达。*P0.05，与Het-1A细胞相比；#P0.05，与Eca-109细胞相比；P0.05，与Ec-1细胞相比。miR-124STAT3 mRNAHet-1AEca-109EC-1EC9706A食管细胞中miR-124与STAT3mRNA的表达6420Het-1AEca-109EC-1EC9706Het-1AEca-109EC-1EC9706BSTAT3-actimSTAT32.01.51.00.50.0 过表达 对食管癌 细胞迁移、侵袭、增殖及凋亡的影响对照组、组、组细胞活力、迁移细胞数、侵袭细胞数及 蛋白表达量依次降低（.）；细胞凋亡率、蛋白表达量依次升高（.）。见表 及图。过表达 对食管癌细胞的影响与 组比较，组细胞活力、迁移、侵袭能力及 表达水平均升高（.）；细胞凋亡率、水平下降（.）。见图 及表。表 过表达 对食管癌 细胞迁移、侵袭、增殖及凋亡的影响（，）组别细胞凋亡率（）细胞活力（）迁移细胞数（个）侵袭细胞数（个）对照组 组 组 .，与对照组相比；.，与 组相比。第 卷 第 期 年 月 川北医学院学报（：.）.，.图2过表达miR-124食管癌EC9706细胞迁移、侵袭、增殖及凋亡的影响A.过表达miR-124对食管癌EC9706细胞凋亡的影响；B.细胞凋亡相关蛋白表达量；C.过表达miR-124对食管癌EC9706细胞迁移、侵袭的影响。ABC105104103102101100101102103105104Q1-10.58%Q1-20.10%Q1-393.30%Q1-46.02%105104103102101100101102103105104Q1-10.65%Q1-20.12%Q1-393.79%Q1-46.44%105104103102101100101102103105104Q1-10.33%Q1-20.13%Q1-378.69%Q1-420.85%BAXBcl-xLCasepase-3-actim对照组miR-NCmiR-124迁移侵袭表 过表达 对食管癌 细胞迁移、侵袭、增殖及凋亡的影响（，）组别细胞凋亡率（）细胞活力（）迁移细胞数（个）侵袭细胞数（个）组 组 .，与 组相比。图3过表达STAT3食管癌EC9706细胞迁移、侵袭、增殖及凋亡的影响A.过表达STAT3对食管癌EC9706细胞凋亡的影响；B.WB检测细胞凋亡相关蛋白表达量；C.过表达STAT3对食管癌EC9706细胞迁移、侵袭的影响。miR-124+pGL3-Basic+STAT3ABBaxBcl-xLCasepase-3-actimmiR-124+pGL3-BasicmiR-124+pGL3-BasicmiR124+pGL3-Basic+STAT3Q1-10.54%Q1-20.15%Q1-386.01%Q1-413.30%Q1-10.51%Q1-20.11%Q1-392.80%Q1-46.58%105104103102101100101102103105104105104103102101100101102103105104C迁移侵袭miR-124+pGL3-BasicmiR124+pGL3-Basic+STAT3miR-124+pGL3-BasicmiR124+pGL3-Basic+STAT3STAT3-actimmiR-NCmiR-124anti-miR-NCanti-miR-124AB图4miR-124靶向调控STAT3表达A.Target-Scan预测miR-124与STAT3之间的结合位点；B.WB检测STAT3蛋白表达量。王元锦，等 通过靶向 表达抑制食管癌的机制研究 与 的靶向关系 过表达可降低 荧光素酶活性，差异有统计学意义（.），而对 荧光素酶活性无影响（.）；与 组比较，组细胞中 蛋白水平降低（.），与 组比较，组细胞中 蛋白水平升高（.）。见图 及表。表 靶向调控 表达（，）组别荧光活性 蛋白 组 组 组 组 .，与 相比；.，与 组相比。讨论尽管随着对肿瘤研究不断的深入，但食管癌仍然是跨学科肿瘤学的重要挑战。近年来，在人类疾病发生及进展中的作用已被广泛研究，并逐渐成为肿瘤疾病的新生标志物。有研究证实了 在宫颈癌、膀胱癌、乳腺癌等肿瘤中的调控作用，但在食管癌中的表达及功能研究尚少。有国外研究显示，在肿瘤细胞中的表达量不足，且 下调与 高分级肿瘤发生位置呈负调控关系。与此相关的另一体内实验表明，将 模拟物直接注射到食管癌模型小鼠的肿瘤中，最终注射有 模拟物小鼠的肿瘤平均重量更低、体积更小。本研究发现，食管癌细胞中 均表达下调（.），与上述研究吻合。此外，过表达 癌细胞活性下降，细胞迁移及侵袭能力减弱，而细胞凋亡率上升，促进凋亡程序的 及 的蛋白表达上调，而相反抑制作用的 蛋白水平降低（均 .），表明 可能发挥抑制食管癌细胞迁移、侵袭及细胞活力，诱导癌细胞凋亡。为进一步探讨 抑制食管癌细胞相关恶性表型的综合生物功能，通过查阅文献资料及搜索基因配对数据库发现，可能与上述过程相关。参与了包括细胞增殖、存活、分化及血管形成等重要生物学过程。此前研究已证实，主要通过磷酸化完成瞬时激活，将转录信号从质膜上的细胞因子和生长因子受体传递到细胞核，在正常细胞中 的表达及活性极度抑制；但在癌细胞组织中被大量激活、扩增，并在多层面发挥介导肿瘤细胞的免疫抑制作用。因此，被认为是肿瘤治疗的潜在靶点。食管癌细胞中 蛋白及其 水平均升高（.）；在进一步研究 与 关系中发现，在 组中 表达上调，而过表达 组中 表达抑制（均 .）；过表达中 水平受到抑制，同时逆转了 诱导细胞凋亡的作用，促进了癌细胞的活力，增加细胞迁移及侵袭能力（均 .），且 与 存在靶向关系。虽然本研究并未探讨