癌胚抗原相关细胞黏附分子源...17对血小板活化作用的研究_万雯.pdf

中国现代医学杂志China Journal of Modern MedicineVol.33 No.7Apr.2023第 33 卷 第 7 期2023 年 4 月癌胚抗原相关细胞黏附分子源性多肽KM17对血小板活化作用的研究*万雯，王华炜，叶雨佳，李龙君，杨理宏，杨晓娜，董玲，陈丽星，孟照辉（昆明医科大学第一附属医院 心内科，云南 昆明 650032）摘要：目的探讨癌胚抗原相关细胞黏附分子（CEACAM1）源性多肽KM17对血小板聚集、释放、黏附功能的影响。方法采用血小板聚集仪观察多肽KM17对凝血酶、胶原、花生四烯酸（AA）、二磷酸腺苷（ADP）等激动剂诱导的血小板聚集的影响；流式细胞术观察多肽KM17对ADP激活血小板后P-选择素释放的影响；显微镜下观察多肽KM17对血小板静态黏附于胶原基质的影响。结果多肽KM17能显著促进ADP诱导的血小板聚集且呈剂量依赖（P 0.05）；此外，多肽KM17对ADP激活血小板后P-选择素释放及血小板静态黏附于胶原基质的差异也无统计学意义（P 0.05）。结论多肽KM17可明显促进ADP诱导的血小板聚集，但对ADP活化血小板后P-选择素释放及血小板静态黏附于胶原基质未见明显作用。关键词：多肽KM17；血小板聚集；二磷酸腺苷；P-选择素；黏附中图分类号：R54文献标识码：AEffect of CEACAM1-derived peptide KM17 on platelet activation*Wan Wen,Wang Hua-wei,Ye Yu-jia,Li Long-jun,Yang Li-hong,Yang Xiao-na,Dong Ling,Chen Li-xing,Meng Zhao-hui(Department of Cardiology,The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming,Yunnan 650032,China)Abstract:Objective To explore the effect of KM17,a synthetic CEACAM1-derived peptide,on platelet aggregation,release,and adhesion.Methods We examined the effect of KM17 on platelet aggregation induced by different agonists(ADP,thrombin,collagen,and AA)with aggregometer.We observed the effect of KM17 on platelet P-selectin release after stimulated by ADP with FCM.The effect of KM17 on platelet adhesion to collagen was observed under a microscope.Results KM17 dose-dependently promoted ADP-induced platelet aggregation(P 0.05).In addition,KM17 had no significant effect on platelet P-selectin release induced by ADP(P 0.05),and there was no significant difference in the numbers of platelet adhesion to collagen after incubated with different concentrations of KM17(P 0.05).Conclusions KM17 dose-dependently promoted platelet aggregation induced by ADP,but had no significant effect on platelet P-selectin release induced by ADP,and on platelet adhesion to collagen.Keywords:KM17;platelet aggregation;adenosine diphosphate;P-selectin;adhesion实验研究 论著DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2023.07.006文章编号：1005-8982（2023）07-0034-06收稿日期：2022-05-23*基金项目：国家自然科学基金（No：81860074）；云南省教育厅科学研究基金项目（No：2022J0193）通信作者 孟照辉，E-mail：；Tel：0871-65324888 34第 7 期万雯，等：癌胚抗原相关细胞黏附分子源性多肽KM17对血小板活化作用的研究癌胚抗原相关细胞黏附分子（carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecules,CEACAMs）属于免疫球蛋白超家族，在细胞黏附、细胞内和细胞间信号转导，以及炎症、血管生成、癌症进展等复杂生物学过程中发挥重要作用1-3。CEACAM1是癌胚抗原超家族成员之一，是I型跨膜受体，通过跨膜区锚定在细胞膜上，其胞内段分别由两种表型的胞质尾区构成（CEACAM1-L），分别是 7073 个氨基酸的长胞质尾段，抑或是 1012 个氨基酸的短胞质尾段（CEACAM1-S）；而其胞外段由氨基末端的 IgV 样结构域及随其后的 13 个 IgC2 样结构域（A1、B和A2）组成2。CEACAM1除广泛表达于免疫细胞、内皮细胞、血液细胞外，也可表达于 人 血 小 板，且 血 小 板 CEACAM1 可 负 性 调 节GPVI-FcR信号通路转导，从而抑制胶原诱导的血小板活化、聚集4-5。此外，有研究显示，血小板可表达和分泌 MMP-12，且分泌的 MMP-12 可裂解血小板 CEACAM1 胞外段 N 端结构域，从而减弱对胶原诱导的血小板活化的抑制作用4。而多项研究6-7表明，MMP-12 酶切 CEACAM1 胞外段后可生成多个活性片段，并进一步影响血小板功能。其中，含 IgC2 样结构域源性多肽 QDTT、QLSN 可抑制多种激动剂诱导的血小板聚集、活化5，而含IgV 样结构域源性多肽 WYKG 可促进胶原诱导的血小板 颗粒释放4。由此可见，源自不同结构域的活性片段对血小板功能的影响可能也有所不同。因此，本研究将进一步探索 CEACAM1 源性含 IgV和IgC2样结构域多肽KM17对血小板活化作用的影响，明确 CEACAM1 胞外段经 MMP-12 剪切脱落的其他结构域源性多肽对血小板活化的影响，深入了解CEACAM1对血小板功能的调控机制。1 材料与方法1.1试剂前期研究6通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）、质谱及测序分析，精确定 位 CEACAM1 细 胞 外 功 能 区 蛋 白 序 列（rhCEACAM1、Ser34-Thr252，26 kD）中 MMP-12 的酶切位点，并成功构建酶切产物的肽指纹图谱。多肽KM17 由江苏金斯瑞生物科技有限公司化学合成，凝血酶、胶原、花生四烯酸（AA）、二磷酸腺苷（ADP）购自美国 Chromon-log 公司，荧光抗体 PerCP Mouse Anti-Human CD61 购自美国 BioLegend 公司，荧光抗体 PE Mouse Anti-Human CD62P、PE Mouse IgG1 Isotype Control 等购自美国 BD 公司，牛血清白蛋白、乙 二 胺 四 乙 酸（EDTA）、HEPES、DMSO、NaCl、KH2PO4、KCl、Na2HPO4、NaHCO3、NaH2PO4等常用试剂购自上海生工生物工程股份有限公司，前列腺素E1（PGE1）购自美国Avanti Polar Lipids公司。磷酸盐缓冲液（PBS）（150 mmol NaCl，2 mmol KH2PO4，2.7 mmol KCl，10 mmol Na2HPO4），5Tyrode s Buffer（50 mmol HEPES，685 mmol NaCl，60 mmol NaHCO3,14 mmol KCl，2.1 mmol NaH2PO4），1Tyrodes Buffer现配现用：取 10 mL 5Tyrode s Buffer，加入去离子水、0.1%葡萄糖、0.25%BSA，总体积50 mL，调整pH至7.4。1.2仪器与设备全自动血细胞分析仪（中国迈瑞公司），血小板聚集仪（美国 Chrono-log 公司），流式细胞仪（美国BD公司），倒置显微镜（日本Olympus公司），倒置显微镜摄像头（中国明美公司）。1.3实验方法1.3.1 洗涤血小板的制备 采用单采血小板，置于 1.5 mL 离心管中；1 941 r/min 离心 10 min，弃去上清液，得到浓缩血小板团块；加入适量 Tyrodes Buffer，并分别加入 PGE1（终浓度为 50 ng/mL）和EDTA（终浓度为 1 mmol/L），轻 柔 吹 打，重 悬 血小 板；1 941 r/min 离心 10 min，弃去上清液，再次得到浓缩血小板团块；用全自动血细胞分析仪测定血小板数目，Tyrodes Buffer调整血小板数目。1.3.2 光扫描比浊法检测血小板聚集 取人洗涤血小板（200109/mL）400 L，加入与血小板聚集仪适配的平底、透明、硅化玻璃杯中；按预先设计分组（溶剂对照组、10 mol/L KM17 组、50 mol/L KM17组、100 mol/L KM17 组）在反应杯中加入不同浓度的 KM17（10 mol/L、50 mol/L、100 mol/L）或等体积的溶剂对照（DMSO），37 下孵育10 min；将转子放入反应杯中，并调整转速为 1 200 r/min，调整基线，待聚集曲线稳定后，设定此时的聚集率为0%；向反应中加入不同激活剂（1.25 mol/L ADP、0.05 u/L凝血酶、250 mol/L AA 及 0.625 g/L 胶原），实时监测并记录血小板聚集曲线。上述实验至少重复 3 次，取监测时间内血小板最大聚集率为实验结果。抑 35中国现代医学杂志第 33 卷 制聚集率计算方法：（Y-X）/Y100%，X代表干预组血小板平均聚集率，Y 代表空白对照组血小板平均聚集率。1.3.3 流式细胞术检测血小板 颗粒的释放情况 取制备好的人洗涤血小板（5107/mL）50 L 加入EP 管中，按预先分组（溶剂对照组、10 mol/L KM17组、50 mol/L KM17 组、100 mol/L KM17 组）在 EP管中加入不同浓度的 KM17（10 mol/L、50 mol/L、100 mol/L）或等体积的溶剂对照（DMSO），37 孵育 10 min；孵育后分别加入激活剂（ADP）并充分混匀，37 C，孵育 10 min；同时加入 CD61、CD62P 荧光抗体，37，避光，孵育20 min；避光情况下，分别加入 250 L PBS 终止反应；立即在流式细胞仪上检测，观察并记录P-选择素的释放率。以上实验每组重复3次以上。1.3.4 血小板在固化胶原上的黏附反应 胶原包被：24孔板内置入匹配的细胞玻片，按分组向孔内分别加入5 g/mL的胶原溶液（PBS稀释）或1%BSA（对照组）300 L，4 下包被过夜，次日移去液体，并用 PBS 洗涤 3 次；封闭：每孔加入 1%BSA 溶液 300 L，室温下封闭 1 h 后移去封闭液，并用 PBS洗涤3次；孵育：不同浓度的KM17（10 mol/L、50 mol/L、10