阿魏酸在辐照处理的微晶纤维素中的稳定性及降解产物分析_寿纪纲.pdf

寿纪纲，等阿魏酸在辐照处理的微晶纤维素中的稳定性及降解产物分析寿纪纲1，2，霍志鹏1，3，王玉1，4，乔敏莎1，刘吉华2，何毅1*（1.天士力医药集团股份有限公司研究院，创新中药关键技术国家重点实验室，天津 300410；2.中国药科大学 中药学院，江苏 南京 211198；3.天津中医药大学 中药学院，天津 301617；4.天津大学 药物科学与技术学院，天津 300072）摘要：辐照灭菌工艺可能使药物辅料降解从而间接影响活性成分的稳定性。考察了微晶纤维素经过60Co 辐照后对阿魏酸稳定性的影响，通过超高效液相色谱法（UPLC）检测样品中阿魏酸的含量变化；通过超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-Q-TOF-MS）对阿魏酸的降解产物进行分析。结果发现辐照处理后的微晶纤维素与阿魏酸混合后可使阿魏酸在一个月内持续降解并产生了一系列降解产物，分别为：3，4-二羟基苯乙酮、咖啡酸、香草酸、二氢阿魏酸、香草醛、松柏醛。推测微晶纤维素在辐照降解的过程中产生了自由基，这些自由基通过不同的作用机制使阿魏酸产生降解，此研究结果可为有关药物灭菌工艺的选择以及辐照降解杂质的产生机制提供参考。关键词：辐照；微晶纤维素；自由基；阿魏酸；降解产物中图分类号：R 28文献标志码：A文章编号：2095-817X（2023）01-0044-007辐照灭菌技术因具有穿透力强、低温灭菌、无有害残留等诸多优势，在中国于上世纪 70 年代开始尝试应用于中药行业并迅速得到推广，但其在产生灭菌作用的同时可能使部分中药成分产生辐射降解 1-2。中国药典2020 年版四部通则 1421 灭菌法中规定辐射灭菌工艺的开发应考虑被灭菌物品对电离辐射的耐受性以及生物负载等因素，应确定最大可接受计量保证灭菌过程不影响被灭菌物品的安全性、有效性及稳定性 3。微晶纤维素是制药工业最常见的辅料之一，常用作片剂或丸剂中的填充剂。有研究表明辐照可使微晶纤维素降解，使其聚合度与粒径降低并产生一些小分子的降解产物 4-5。目前关于微晶纤维素的辐照降解机制尚无定 收稿日期：2022-11-28基金项目：国家“重大新药创制”科技重大专项（2017ZX0930 1005）。作者简介：寿纪纲（1996），男，硕士研究生在读，研究方向是中药资源开发与质量评价。*通信作者：何毅（1977），女，研究员，从事中药新药开发与研究工作。论 6。Phillips G.O.7等认为纤维素的辐照降解遵循自由基机理；Liu 等 8通过 FT-IR、EPR、NMR 分析表明辐照破坏了微晶纤维素的糖苷键、分子间和分子内氢键并导致大量自由基的产生。因此推测辐照灭菌工艺会造成以微晶纤维素作为辅料的中成药中部分活性成分降解。阿魏酸作为一种典型的中药活性成分，广泛分布于当归、川芎、升麻等常用药材中，其化学结构决定了其具有较强的抗氧化性与其他反应活性 9。计划探究常见辅料微晶纤维素经过60Co辐照后对中药活性成分阿魏酸的稳定性影响，通过超高效液相色谱法（UPLC）观察辐照后的微晶纤维素加阿魏酸样品中阿魏酸的含量变化；通过超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-Q-TOF-MS）对阿魏酸在辐照处理的微晶纤维素中的降解产物进行分析并由此对其与阿魏酸的作用机制进行初步预 测。1 仪器与试药1.1 仪器Synapt G2 Q-TOF 型 质 谱 仪（美 国 Waters 公44化 工 与 医 药 工 程第44卷第1期2023年2月出版Chemical and Pharmaceutical Engineering 2023，44(1)医药工艺与工程司），Acquity UPLC I-CLASS 超高效液相色谱仪（美国 Waters 公司），XS205DU 型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），VT613OP 真空干燥箱（美国Thermo Fisher 公司），Milli-Q 型超纯水系统（美国密理博公司），KQ-500DV 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。1.2 药品与试剂阿魏酸（阿拉丁试剂（上海）有限公司，批号 E2124158，质量分数 99%）、微晶纤维素（曲阜市天利药用辅料有限公司，批号 200512A），磷酸（国药集团化学试剂有限公司，批号 20131010，分析纯）、甲酸（梯希爱化成工业发展有限公司，批号 UUQBH-VE，质谱纯），乙腈（默克公司，批号 JB100130，色谱纯），甲醇（默克公司，批号I1106007032，色谱纯），实验用水为 Milli-Q 型超纯水系统制备超纯水。2 方法与结果2.1 样品与溶液的制备2.1.1 辐照样品的准备取阿魏酸对照品加入乙醇适量使完全溶解，配制成质量浓度约为 10 mg/mL 的阿魏酸乙醇溶液并将其与适量微晶纤维素混合，充分搅拌后置于真空干燥箱中在 50 恒温条件下真空干燥 6 h，取出后再次充分震荡混合即得微晶纤维素-阿魏酸样品，其中阿魏酸含量约为 0.8 0.9 mg/g，记为样品 a。分别取适量阿魏酸对照品、样品 a、空白微晶纤维素装入自封袋中，于室温条件下进行辐照处理。辐射源为60Co，辐照剂量为 8 kGy。将辐照后的空白微晶纤维素按照与样品 a 相同的制备方法，制备成辐照微晶纤维素-阿魏酸样品，其中阿魏酸含量约为 0.8 0.9 mg/g，记为样品 b。图 1 样品 a、辐照样品 a、样品 b 的制备流程Fig.1 Preparation process of sample a，irradiation sample a and sample b微晶纤维素阿魏酸的乙醇溶液充分混合50 真空干燥60Co 辐照6 h8 KGy微晶纤维素加阿魏酸样品样品 a辐照样品 a辐照微晶纤维素阿魏酸的乙醇溶液充分混合50 真空干燥60Co 辐照6 h8 KGy微晶纤维素加阿魏酸样品样品 b微晶纤维素2.1.2 用于 UPLC-UV 样品的制备对于阿魏酸对照品，称取阿魏酸约 10 mg 至100 mL 容量瓶中，精密称定，加适量 70%甲醇使完全溶解，定容至刻度线，摇匀即得。对于样品 a、辐照样品 a 与样品 b，取约 1 g 于适当容器中，精密称定，精确加入 70%甲醇 25 mL，密塞后超声提取 30 min，放冷，补足失重后摇匀，滤过即得。2.1.3 用于 UPLC-Q-TOF-MS 样品的制备取辐照前与放置 30 天的辐照样品 a 各 1 g 于适当容器中，精密称定，精确加入色谱甲醇 5 mL，密塞后超声提取 10 min，摇匀，滤过即得。2.2 色谱条件2.2.1 用于 UPLC-UV 检测的色谱条件ACQUITY_UPLC_HSS_T3 色 谱 柱（1.8 m，100 mm2.1 mm）；流 动 相 为 0.1%磷 酸（A）-乙腈（B），等度洗脱（0 5 min，18%B）；检测波长为310 nm，流速 0.3 mL/min，柱温 35，进样量 2 L。2.2.2 用于 UPLC-Q-TOF-MS 分析的色谱-质谱条件色 谱 条 件：ACQUITY_UPLC_HSS_T3 色 谱 柱（1.8 m，100 mm2.1 mm）；流动相为 0.1%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0 5 min，18%B；5 10 min，18%80%B）；波长扫描范围（190 400 nm），流速0.3 mL/min，柱温 35，进样量 2 l。质谱条件：采用电喷雾离子源（ESI），负离子检测模式，扫描范围为 m/z50 1 200，以全信息串联质谱（MSE）模式采集质谱数据。毛细管电压 3.5 kV，锥孔电压 40 V，离子源温度 110。以高纯氮气（N2）为雾化气，流速 50 L/h；脱溶剂气（N2）流速 800 L/h，脱溶剂气温度 350 ；以高纯氩气（Ar）为碰撞气，低能量扫描无碰撞能，高能量MSE模式扫描碰撞能 20 60 eV；干燥气温度 350，45寿纪纲，等.阿魏酸在辐照处理的微晶纤维素中的稳定性及降解产物分析干燥气流速 10 L/min。以浓度为 2 mg/L 的亮氨酸-脑 啡 肽（leucine-enkephalin，m/z 554.261 5 M-H-，m/z 556.277 1 M+H+）作为校正液实时校正，流速10 L/min。2.3 样品中阿魏酸的定量分析2.3.1 专属性试验按“2.2.1”项下色谱条件，将阿魏酸对照品溶液、样品 a 的供试品溶液与空白微晶纤维素的供试品溶液分别进样，结果见图 2。阿魏酸出峰位置无干扰，表明此检测方法专属性良好。A：辐照处理前的样品 a；B：阿魏酸对照品；C：空白微晶纤维素图 2 专属性试验结果Fig.2 Specificity test resultsABC0.004.002.006.001.005.003.007.008.009.002.3.2 精密度试验按“2.2.1”项下色谱条件，将阿魏酸对照品溶液连续进样 6 次，测定峰面积。结果表明，阿魏酸峰面积的相对标准偏差 RSD 为 0.20%，表明仪器的精密度良好。2.3.3 线性关系考察取 阿 魏 酸 对 照 品 溶 液 适 量，以 70%甲 醇作 为 稀 释 溶 剂 倍 比 稀 释，得 到 质 量 浓 度 分 别为 156.31 g/mL、78.16 g/mL、39.08 g/mL、19.54 g/mL、9.77 g/mL、4.88 g/mL 的对照品溶液。以峰面积对质量浓度进行线性回归，得到线性方程为y=33 384 x+19 320，R2=0.999 8。结果表明阿魏酸在4.88 156.31 g/mL 范围内呈良好的线性关系。2.3.4 稳定性试验按“2.2.1”项下色谱条件，分别取对照品溶液及样品 a 的供试品溶液于 0、4、8、12、16、24 h 重复进样 6 次，测定峰面积。结果表明，对照品稳定性中阿魏酸 RSD 为 0.76%；供试样品稳定性中阿魏酸RSD 为 0.34%。稳定性检测均符合要求。2.3.5 重复性试验按照“2.1.2”项供试品溶液的制备方法平行制备 6 份样品 a 的供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别进样检测，测定峰面积。结果表明，6 个平行样品中阿魏酸峰面积的相对标准偏差为 0.25%，阿魏酸的平均含量为 0.85 mg/g。重复性符合要求。2.3.6 加样回收率试验准确称取6份样品a于适当容器中，每份约0.5 g，分别加入阿魏酸对照品 0.5 mg（即相当于样品中阿魏酸含量的 100%）并按照“2.1.2”项供试品溶液的制备方法制备为样品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别进样检测，测定峰面积。结果如表 1 所示，6个加样回收样品的平均加样回收率及 RSD 分别为99.34%、0.75%，表明此方法的准确度较好。2.3.7 样品中阿魏酸的含量测定按“2.2.1”项下色谱条件，分别于制备后 0、7、14、30 d 检测样品 a 中的阿魏酸含量，样品 a 在制备后的 30 d 内阿魏酸含量基本保持稳定，如图 3A 所示。对于辐照样品 a 和样品 b，分别于辐照前和辐照后 0、1、2、3、7、14、30 d 检测阿魏酸含量。相比于辐照前，辐照样品 a 阿魏酸相对含量下降 37.18%且呈持续下降趋势，至辐照后第 30 天阿魏酸相对含量下降44.57%，如图 3B 所示；样品 b 在制备后的 30 d 内阿魏酸含量呈持续下降趋势，至制备后第 30 d 阿魏酸相对含量下降 34.83%，如图 3C 所示。2.4 辐照处理后样品中阿魏酸的降解产物分析对“2.1.3”项样品采用 UPLC-Q-TOF-MS 技术进行分析，分别收集检测样品的色谱图与负离子模式下基峰离子流图（BPI），如图 4 所示。根据基峰离子流图推测阿魏酸降解产物的分子离子与裂解规律信息，如表 2 所示。46化 工 与 医 药 工 程第44卷第1期2023年2月出版Chemical and Pharmaceutical Engineering 2023，44(1)A：样品 a 制备完成后；B：样品 a 辐照处理后；C：样品 b 制备完成后图 3 各样品