第32卷第4期Vol.32，No.4129-1412023年4月草业学报ACTAPRATACULTURAESINICA姚佳明，郝欢欢，张敬，等.tRNA-sgRNA/Cas9系统介导多年生黑麦草原生质体的基因编辑.草业学报，2023，32（4）：129−141.YAOJia-ming，HAOHuan-huan，ZHANGJing，etal.TheuseofthetRNA-sgRNA/Cas9systemforgeneeditinginperennialryegrassprotoplasts.ActaPrataculturaeSinica，2023，32（4）：129−141.tRNA-sgRNA/Cas9系统介导多年生黑麦草原生质体的基因编辑姚佳明，郝欢欢，张敬，徐彬*（南京农业大学草业学院，江苏南京210095）摘要：tRNA可以将多个sgRNAs连接起来合并成一个多顺反子基因，再与CRISPR/Cas9表达载体结合形成多顺反子tRNA-sgRNA/Cas9（PTG/Cas9）系统来对多靶点进行基因编辑。该系统已经在水稻中验证其可促进sgRNAs的转录和提高多靶点的编辑效率。因此，为了在多年生黑麦草中实现高效的基因编辑，本研究中，构建了2个带有tRNA的CRISPR中间载体，并提供了一种快速、灵活的PTG/Cas9载体构建方法。为了快速验证PTG/Cas9系统是否可以在多年生黑麦草基因组中发挥功能，用聚乙二醇4000（PEG4000）介导PTG/Cas9质粒转化多年生黑麦草原生质体，后提取原生质体DNA扩增目的序列检测是否有目标基因被编辑的细胞。试验结果显示，PTG/Cas9系统可用于多年生黑麦草基因编辑，且基因编辑效率约为6.7%。试验结果为多年生黑麦草遗传研究和育种提供了重要的基础。关键词：CRISPR/Cas9；tRNA；多基因编辑；载体；质粒；原生质体；多年生黑麦草TheuseofthetRNA-sgRNA/Cas9systemforgeneeditinginperennialryegrassprotoplastsYAOJia-ming，HAOHuan-huan，ZHANGJing，XUBin*CollegeofAgro-grasslandScience，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，ChinaAbstract：TransferRNA（tRNA）canlinkmultiplesgRNAs（single-guideRNAs）toformapolycistronicgene，whichthencombineswithaCRISPR/Cas9（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associatedgene9）expressionvectortoformapolycistronictRNA-sgRNA/Cas9（PTG/Cas9）systemformultiplegeneediting.ThePTG/Cas9systemhasbeenusedtoaltersgRNAstranscriptlevelsandimprovemulti-targeteditingefficiencyinrice（Oryzasativa）.Toefficientlyedittargetgenesinperennialryegrass（Loliumperenne），wegeneratedtwoCRISPRintermediatevectorswithtRNAstoprovideafastandflexiblePTG/Cas9vecto...
