tRNA-sgRNA_Ca...生黑麦草原生质体的基因编辑_姚佳明.pdf

第 32 卷第 4 期Vol.32，No.4129-1412023 年 4 月草业学报ACTA PRATACULTURAE SINICA姚佳明，郝欢欢，张敬，等.tRNA-sgRNA/Cas9系统介导多年生黑麦草原生质体的基因编辑.草业学报，2023，32（4）：129141.YAO Jia-ming，HAO Huan-huan，ZHANG Jing，et al.The use of the tRNA-sgRNA/Cas9 system for gene editing in perennial ryegrass protoplasts.Acta Prataculturae Sinica，2023，32（4）：129141.tRNA-sgRNA/Cas9系统介导多年生黑麦草原生质体的基因编辑姚佳明，郝欢欢，张敬，徐彬*（南京农业大学草业学院，江苏 南京 210095）摘要：tRNA 可以将多个 sgRNAs连接起来合并成一个多顺反子基因，再与 CRISPR/Cas9表达载体结合形成多顺反子 tRNA-sgRNA/Cas9（PTG/Cas9）系统来对多靶点进行基因编辑。该系统已经在水稻中验证其可促进 sgRNAs的转录和提高多靶点的编辑效率。因此，为了在多年生黑麦草中实现高效的基因编辑，本研究中，构建了 2个带有tRNA 的 CRISPR 中间载体，并提供了一种快速、灵活的 PTG/Cas9载体构建方法。为了快速验证 PTG/Cas9系统是否可以在多年生黑麦草基因组中发挥功能，用聚乙二醇 4000（PEG 4000）介导 PTG/Cas9质粒转化多年生黑麦草原生质体，后提取原生质体 DNA 扩增目的序列检测是否有目标基因被编辑的细胞。试验结果显示，PTG/Cas9系统可用于多年生黑麦草基因编辑，且基因编辑效率约为 6.7%。试验结果为多年生黑麦草遗传研究和育种提供了重要的基础。关键词：CRISPR/Cas9；tRNA；多基因编辑；载体；质粒；原生质体；多年生黑麦草The use of the tRNA-sgRNA/Cas9 system for gene editing in perennial ryegrassprotoplastsYAO Jia-ming，HAO Huan-huan，ZHANG Jing，XU Bin*College of Agro-grassland Science，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，ChinaAbstract：Transfer RNA（tRNA）can link multiple sgRNAs（single-guide RNAs）to form a polycistronic gene，which then combines with a CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated gene 9）expression vector to form a polycistronic tRNA-sgRNA/Cas9（PTG/Cas9）system for multiplegene editing.The PTG/Cas9 system has been used to alter sgRNAs transcript levels and improve multi-targetediting efficiency in rice（Oryza sativa）.To efficiently edit target genes in perennial ryegrass（Lolium perenne），wegenerated two CRISPR intermediate vectors with tRNAs to provide a fast and flexible PTG/Cas9 vectorconstruction method.To verify whether the PTG/Cas9 system effectively edits genes in the perennial ryegrassgenome，we introduced the PTG/Cas9 plasmid into perennial ryegrass protoplasts by PEG 4000-mediatedtransformation.Then，we extracted DNA from protoplasts and amplified the target sequences to determine whetherthey had been edited successfully.The gene editing efficiency was about 6.7%.These results show that the PTG/Cas9 system can be used for gene editing in the ryegrass genome，and provide the basis for further genetic researchon，and breeding of perennial ryegrass.DOI：10.11686/cyxb2022180http：/收稿日期：2022-04-20；改回日期：2022-06-27基金项目：国家自然科学基金（31971757）资助。作者简介：姚佳明（1996-），男，河北保定人，在读硕士。E-mail： 通信作者 Corresponding author.E-mail：Vol.32，No.4ACTA PRATACULTURAE SINICA（2023）Key words：CRISPR/Cas9；tRNA；multiple gene editing；vector；plasmid；protoplasts；perennial ryegrass2012 年，珍妮弗道德纳（Jennifer Doudna）和埃玛纽埃勒沙尔庞捷（Emmanuelle Charpentier）团队1发现规律 间 隔 成 簇 短 回 文 重 复 序 列 衍 生 RNA（clustered regularly interspaced short palindromic repeat derived RNA，CRISPR derived RNA，crRNA）和反式激活 crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）可连接成向导 RNA（smallguide RNA，sgRNA）引导 CRISPR associated 9（Cas9）蛋白靶向和切割 DNA 序列。随后，2013年，张锋团队证明了 CRISPR/Cas9系统可以在人类和小鼠细胞中进行精确切割，并且发现一个 CRISPR 阵列（CRISPR array）可以编码多个不同的 sgRNAs，从而编辑基因组中的不同位点2。此后，CRISPR/Cas 系统作为基因编辑工具在细菌3、酵母4、斑马鱼5、果蝇6、人类细胞7和植物8等不同物种中得以应用。以 CRISPR/Cas9 为例，典型的CRISPR/Cas9基因座（CRISPR locus）主要由四部分组成9-10：tracrRNA、CRISPR 阵列、前导序列（leader）和 Cas基因。tracrRNA 和 crRNA 可以通过碱基互补配对结合形成 tracrRNA-crRNA 复合物，引导 Cas9蛋白结合 DNA双链发挥功能11-12。而在目前的应用中，通常将 tracrRNA 和 crRNA 整合成一个 sgRNA，由 RNA 聚合酶（polymerase，Pol）启动子转录出来，通过碱基配对，自折叠成部分双链的 RNA 结构，与 Cas9蛋白结合发挥功能2。在 植 物 中，Cas9 通 常 与 核 融 合 定 位 信 号（nuclear localization signal，NLS）相 融 合，在 RNA 聚 合 酶（polymerase，Pol）启动子驱动下表达，而 sgRNAs通常是由 Pol 启动子驱动转录表达13。根据双子叶植物和禾本科植物的转录调控特点，常用的 Pol 启动子为椰菜花（Brassica oleracea）叶病毒的 35S启动子（CaMV35S启动子，适用于双子叶植物）或玉米（Zea mays）泛素启动子（ubiquitin启动子，ZmUbiP，适用于禾本科植物），而常用的 Pol 启动子为拟南芥（Arabidopsis thaliana）或水稻（Oryza sativa）的 U3/U6型启动子（分别适用于双子叶植物和禾本科植物）13。而 CRISPR/Cas9系统可以通过表达 Cas9和多个针对不同位点的 sgRNAs来实现多基因的靶向编辑。一个sgRNA 表达盒通常包括一个 Pol 启动子、sgRNA 和 Pol 终止子，通过串联多个 sgRNA 表达盒可以实现多个sgRNAs的共表达，进而实现多个基因的共同编辑14-16。在实际操作中，构建包括串联多个 sgRNA表达盒载体的难度大，且植物遗传转化效率也常受到载体长度的限制。为避免这些弊端，Xie等17将多个 sgRNAs在 tRNA 的间隔下串联起来，组成一个多顺反子（polycistronic tRNA-sgRNA，PTG）序列，由一个 Pol 启动子驱动表达。在串联排列的 tRNA-sgRNA 转录本中，tRNA 可被植物中的核糖核酸酶 P（ribonuclease P，RNase P）和核糖核酸酶 Z（ribonuclease Z，RNase Z）识别并切割下来，进而释放多个不同的 sgRNA。此外，由于 tRNA 内的 box A 和 box B元件能够招募转录因子和 Pol，PTG 的转录效率比单个 sgRNA 更高18-19。在水稻中，已证实 PTG/Cas9系统的基因编辑效率高于传统 CRISPR/Cas9 系统17，20。但目前，用 PTG/Cas9 系统来介导多年生黑麦草（Loliumperenne）的基因编辑还未见报道。因此，为了便于构建针对多重靶基因或靶位点的 PTG 载体，本研究进一步改造了刘耀光院士实验室构建的 pYLCRISPR-sgRNA 中间载体14，创制改造成一套 sgRNA 中间载体：pYLsgRNA-OsU3-tRNA（POT）和 pYLsgRNA-tRNA（PT）。该套 sgRNA 中间载体更便于利用 PCR 重叠延伸法获得串联排列的“tRNA-sgRNA-tRNA-sgRNA-”的 PTG序列。多年生黑麦草为禾本科早熟禾亚科黑麦草属植物，是重要的冷季型牧草和草坪草。但高温胁迫常常限制多年生黑麦草的推广应用21。在前期研究中，发现了一个叶绿素降解酶编码基因 LpNOL（non-yellow coloring 1-like）的表达水平与多年生黑麦草的耐热性呈负相关，并且也已经获得了 RNAi：LpNOL的转基因多年生黑麦草株系22-23。但该 RNAi转基因株系很难在黑麦草育种中应用，其主要限制因素有以下两点：第一，由于存在外源插入的 T-DNA 片段，转基因植株的应用受到严格监管，且公众接受度不高；第二，在该转基因黑麦草中，LpNOL 的表达受到组成型抑制，导致不仅高温诱导下的叶绿素降解受到抑制，正常衰老叶片中的叶绿素降解也受到抑制，进而可能影响了正常衰老叶片中的营养元素循环和转运，使转基因黑麦草的分蘖数显著减少。为了规避 lpnol功能丧失型突变体的潜在缺陷，本研究拟利用 CRISPR/Cas9技术仅突变 LpNOL 启动子（pLpNOL）中存在的热激130第 32 卷第 4 期草业学报 2023 年顺式作用元件，而并非直接破坏其基因的编码序列，特异性地抑制 LpNOL 基因在高温胁迫下的表达，以