TLR2_TLR4在失血性...号通路分子表达上调中的作用_蒋孙班.pdf

免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.2023 论著 文章编号1000-8861（2023）03-0199-09；DOI10.13431/ki.immunol.j.20230026TLR2/TLR4在失血性休克引发的脾组织TIPE2和TLR2/TLR4信号通路分子表达上调中的作用蒋孙班，王朝，杜会博，张立民，赵振奥，赵自刚，蒋丽娜*摘要 目的 研究发现，肠淋巴液回流是导致失血性休克后免疫功能紊乱的重要因素。本研究应用TLR2-/-和TLR4-/-小鼠探讨失血性休克对脾组织TIPE2和TLR2/TLR4信号下游分子表达的影响。方法 将不同（C57BL/6J、TLR2-/-、TLR4-/-）来源雄性小鼠随机分为Sham组、Shock组、Shock+Drainage组，分别予以不同手术处理后，无菌获取各实验组小鼠的脾组织。应用RT-PCR技术分别检测WT小鼠脾组织TIPE2、TLR2、TLR4、MyD88、TRIF、TRAF3、TRAF6的mRNA表达。应用Western blotting技术分别检测不同小鼠（C57BL/6J、TLR2-/-、TLR4-/-）脾组织TIPE2、TLR2、TLR4、MyD88、TRIF、TRAF3、TRAF6的蛋白表达。结果 与Sham组相比，失血性休克后脾脏组织TIPE2、TLR2/TLR4及其下游分子表达水平均上调，肠淋巴液引流显著降低了失血性休克导致的TIPE2、TLR2/TLR4及其下游分子的高表达。TLR2的缺失降低了Shock组脾组织TIPE2、TLR4、MyD88、TRAF6的蛋白表达。TLR4缺失降低了Shock组TIPE2、TLR2、MyD88、TRIF、TRAF6的蛋白表达。结论 以TLR2、TLR4作为干预靶点，TIPE2可能通过负反馈机制调控TLR2/TLR4信号通路下游分子mRNA和蛋白的表达，有利于促进失血性休克后免疫平衡状态的恢复。关键词 失血性休克；休克后肠系膜淋巴液；肿瘤坏死因子诱导蛋白8样分子2；TLR2/TLR4信号通路中图分类号 R392.32文献标识码 ARoles of TLR2/TLR4 in hemorrhagic shock-induced up-regulation ofTIPE2 and TLR2/TLR4 signaling molecules in spleen tissueJIANG Sunban,WANG Zhao,DU Huibo,ZHANG Limin,ZHAO Zhen ao,ZHAO Zigang,JIANG Li na*Institute of Microcirculation,Hebei North College,Zhangjiakou 075000,China*Corresponding Author:JIANG Li na,E-mail：Abstract Tumor necrosis factor-induced protein 8-like molecule 2 is an important protein for maintainingimmune dynamic homeostasis.Immune dysfunction is an important factor in the development of sepsis or septicshock after hemorrhagic shock.Recent studies have found that intestinal lymphatic reflux is an important factorcontributing to immune dysfunction after hemorrhagic shock.In this study,TLR2-/-and TLR4-/-mice were used toinvestigate the effect of hemorrhagic shock on the expression of TIPE2 and TLR2/TLR4 signaling downstreammolecules in splenic tissues.Male mice from different genotypes(C57BL/6J,TLR2-/-,TLR4-/-)were randomlydivided into Sham,Shock and Shock+Drainage groups.The spleen tissues were obtained aseptically from eachexperimental group after different surgical treatments.RT-PCR was used to detect the mRNA expressions of TIPE2,TLR2,TLR4,MyD88,TRIF,TRAF3 and TRAF6 in splenic tissues of WT mice;Western blot was used to detect theprotein expressions of TIPE2,TLR2,TLR4,MyD88,TRIF,TRAF3 and TRAF6 in splenic tissues of different mice(C57BL/6J,TLR2-/-,TLR4-/-).Compared with the Sham group,the expression levels of TIPE2,TLR2/TLR4 and theirdownstream molecules were upregulated in splenic tissues after hemorrhagic shock.And the drainage of intestinallymphatic significantly decreased the high expression of TIPE2,TLR2/TLR4 and their downstream moleculescaused by hemorrhagic shock.Lack of TLR2 decreased the protein expressions of TIPE2,MyD88,TLR4 and TRAF6in splenic tissues of Shock group,while Lack of TLR4decreased the protein expression of TIPE2,TLR2,MyD88,TRIF,TRAF6 in Shock group.In conclusion,TLR2 or TLR4 acts as an intervention target,and TIPE2基金项目：国家自然科学青年基金项目（81701963）；河北省自然科学基金面上项目（H2020405023）作者单位：075000 张家口，河北北方学院微循环研究所*通信作者：蒋丽娜，E-mail：199免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.2023失血性休克又称为低血容量性休克，是由于脉管系统血容量减低，灌注压严重不足造成的1，易进展为器官功能障碍，并引发多器官功能障碍综合征（multi-organ dysfunction syndrome,MODS）而发生死亡2-3。随着医疗水平的不断进步，尽管出现一些新的诊断和治疗手段，但创伤、外科手术中严重失血而发生失血性休克（hemorrhagic shock,HS）的概率依然很高4-5。因此，如何降低失血过多患者的高死亡率一直是全球人类面临的重大挑战。脾脏是人体重要的外周免疫器官，通过支持物理滤过及促进淋巴细胞相互作用发挥其广泛的免疫效应，在维持机体免疫稳态方面发挥着重要的作用6。研究表明，失血性休克后，肠系膜淋巴结的免疫屏障功能受损，包括树突状细胞，T细胞在内的免疫细胞数量减少7-9，导致机体细胞免疫稳态的失衡10。失 血 性 休 克 后 肠 淋 巴 液 的 回 流（post-hemorrhagic shock mesenteric lymph,PHSML）是导致失血性休克后脾组织损伤和细胞免疫功能紊乱的重要原因，因而引流肠系膜淋巴液可逆转器官损伤，改善细胞免疫功能，减少炎症反应11，减轻失血性休克对机体的损害。众所周知，机体遭受严重创伤后，损伤或坏死的细胞向外界释放各种损伤相关分子模式（damage-associated molecular pattern,DAMP）。这些介体会被包括Toll 样受体(Toll-like receptors,TLR)在内的模式识别受体感知，进一步引发复杂的免疫反应12。越来越多的研究表明，TLR及其下游重要分子MyD88-TRAF6轴和TRIF-TRAF3轴在炎症性疾病中的信号转导过程中发挥重要作用13-15，且TLR2/TLR4信号通路在维持机体免疫平衡过程中的协同作用被认为是其中的关键因素16-17。下调免疫细胞中TLR的表达可以降低其固有免疫应答水平，进而减少损伤18-19。近期有研究表明，TLR4可能是巨噬细胞凋亡引发机体免疫紊乱的潜在治疗靶点20。TIPE2是维持免疫平衡的必需蛋白，通过与细胞表面的Toll样受体或TCR受体结合，发挥调控机体炎症水平的作用21-22，目前其在失血性休克后免疫功能紊乱中的作用尚不清楚。我们的前期研究发现，失血性休克后肠淋巴液的引流下调TLR2/TLR4相关分子及TIPE2的表达，但其详细的分子机制还有待进一步阐明。因此，我们应用TLR2-/-和TLR4-/-小鼠探讨失血性休克后对脾组织 TIPE2 与 TLR2/TLR4下游信号通路分子的影响，进一步明确TLR2/TLR4介导的TIPE2在肠淋巴液引流减轻失血性休克中的作用机制。1材料与方法1.1实验动物实验用 C57BL/6J 小鼠，SPF 级雄性，810周，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司。TLR4-/-和TLR2-/-基因敲除小鼠，SPF级雄性，810周，购自上海南方模式生物科技股份有限公司（实验动物许可证号：SCXK（沪）2019-0002）。小鼠饲养于温度(232)、湿度(5010)%的环境中，实验前禁食12 h，自由饮水。实验动物的实验程序经过河北北方学院伦理委员会批准，所有操作均遵守国家实验动物饲养健康指南规范。1.2主要试剂及仪器抗TLR2 抗体（ab209217），抗 MyD88 抗 体（ab219413），抗 TRAF3 抗 体（ab36988），抗TRAF6 抗体（ab33915），抗TLR4 抗体（ab13556），抗TRIF抗体（ab39281）购自 美国Abcam公 司；抗 TIPE2 抗 体（15940-1-AP）购 自 中 国Proteintech 公 司。鼠 抗 -Actin 单 克 隆 抗 体（C1313-100）、HRP-标记羊抗兔 IgG 单克隆抗体（C1703）、HRP 标记兔抗鼠 IgG 多克隆抗体（C1717）均购自北京普利莱基因技术有限公司；mRNA快速提取试剂盒（RN001），组织mRNA提取试剂盒plus（RN002 plus），快速逆转录试剂盒（RT001），2SYBR Green qPCR Master Mix（QP002）购买自上海亦衫生物科技有限公司；TLR2、TLR4、MyD88、TRIF、TRAF3、TRAF6、TIPE2引物均委托上海生工生物工程股份有限公司合成。实时荧光定量PCR仪购买自美国 Applied Biosystems 公司，Westernmay regulate the mRNA and protein expression of downstream molecules of TL