Brevibacillus...化鉴定及生物合成基因簇分析_周向平.pdf

核 农 学 报 2023，37（5）：09270935Journal of Nuclear Agricultural SciencesBrevibacillus brevis B011次级代谢物中抗青枯菌活性物质的纯化鉴定及生物合成基因簇分析周向平1 陈武2 刘天波3 王运生2 王凯歌1 刘峰1 李小慧1 袁志辉4，5，*（1湖南省烟草公司永州市公司，湖南 永州 425100；2湖南农业大学植物保护学院，湖南 长沙 410128；3湖南省烟草科学研究所，湖南 长沙 410004；4湖南科技学院化学与生物工程学院，湖南 永州 425199；5湖南省银杏工程技术研究中心，湖南 永州 425199）摘要：青枯病是世界上最为严重的植物细菌性病害之一，生物防治是防控其危害的热点研究领域，而分泌抑菌活性物质被认为是生防菌抑制病原菌的主要作用机制。本研究在前期筛选到对青枯菌有良好拮抗活性的短短芽孢杆菌B011（Brevibacillus brevis B011）基础上，采用色谱法分离纯化到抗青枯菌的主要活性物质，通过串联质谱和核磁波谱分析方法鉴定了其结构，并根据B011菌株全基因组序列，预测了活性化合物生物合成相关基因及其合成途径。结果表明，B.brevis B011次生代谢物中抑制青枯菌的主效活性物质为伊短菌素A（edeine A），次效活性物质为N-乙酰基色胺 N-（2-（1H-indol-3-yl）ethyl）acetamide。这两种化合物对青枯菌的抑制活性为首次报道。基因簇预测结果表明，B011菌株基因组中存在完整的edeine合成基因簇，共包括17个基因，即edeAedeQ，且基因簇中的基因结构完整，基因序列高度保守。B011基因组中有多个N-乙酰基色胺的生物合成相关基因，包括17个脱羧酶编码基因和54个乙酰转移酶编码基因，可能分别参与色氨酸脱羧反应和色胺的乙酰基转移反应，但具体由哪些基因参与还需进一步的研究。研究结果可为该生防菌的应用提供理论指导，也可为后续解析其生物合成途径及通过合成生物学方法进行定向改造奠定基础。关键词：短短芽孢杆菌；伊短菌素A；N-乙酰基色胺；生物合成基因簇DOI：10.11869/j.issn.1000-8551.2023.05.0927青枯病是由青枯劳尔氏菌（Rasltonia solanacearum，简称青枯菌）引起的一种毁灭性土传病害，青枯菌寄主范围广泛，可侵染包括茄科植物在内的 400 多种植物 1，包括重要的粮食、经济和蔬菜作物。青枯病菌主要通过土壤传播并侵染寄主根系，然后在导管中大量繁殖，使导管堵塞，水分运输受阻，进而使地上部因缺水萎蔫而枯死2。细菌性维管束病害所具有的致病机理使青枯病难以防治，是农作物特别是茄科作物如番茄、辣椒、马铃薯和烟草等生产上的重要限制因子，已造成不可挽回的经济损失3-4，使得青枯病成为世界上较为严重的植物细菌性病害之一。二十世纪末至今，大量田间-温室试验已经广泛评估了轮作、嫁接、土壤改良剂、土壤熏蒸、化学防治等方法对青枯病的防控作用5。但每种方法都存在明显的缺陷，如轮作模式周期长，对灌溉资源要求高，会减少有效种植面积；土壤改良剂可选择的种类少，对土壤结构破坏大，且防控效果不能满足实际生产要求等。生物防治具有安全无公害、长效等优点，是当前防控青枯病的研究热点，如赖宝春等6采用复合拮抗放线菌的方式防治番茄青枯病的盆栽防效可达82.03%；蔡傅红等7采用的伊利石吸附W51菌剂在温室试验中对番茄青枯病的防效为62.29%，表现出了较好的防治效果。生物防治的作用机制可分为竞争营养和生态位、分泌抑菌活性物质、寄生（寄生病原菌，如噬菌体等）和诱导寄主产生系统性抗性等，其中分泌抑菌活性物质被认为是生防菌抑制病原菌的主要作用机制8。文章编号：1000-8551（2023）05-0927-09收稿日期：2022-10-09 接受日期：2022-12-27基金项目：湖南省教育厅科学研究项目重点项目（21A0519），湖南省重点研发计划项目（2022NK2050），湖南省烟草公司永州市公司科技项目（YZ2022KJ04）作者简介：周向平，男，高级农艺师，主要从事作物病虫害防控研究。E-mail：*通讯作者：袁志辉，男，副教授，主要从事微生物资源开发与利用研究。E-mail：zhh_927核农学报37 卷 前期研究结果表明，湖南农业大学植物保护学院作物病虫害防控实验室从烟草根系土壤中筛选到的短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）B011的无菌发酵液对青枯病菌有良好的拮抗活性，说明B011具有合成并分泌抑菌活性物质至胞外的能力。拮抗菌的抑菌活性物质主要来源于核糖体合成和非核糖体合成两大途径9-10。目前，从短短芽孢杆菌中纯化并鉴定的具有抑菌活性的次生代谢产物主要是抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）和非核糖体肽（non-ribosomal peptides，NRPs）11-12。其中，典型的AMPs均由核糖体合成，包括侧孢霉灵（laterosporulin）、侧孢霉灵10（laterosporulin10）和 Bac-GM100 等11。NRPs 则包括线性 NRPs（linear NRPs）、环状 NRPs（cyclic NRPs）、线性脂肽（linear lipopeptides）和环脂肽（cyclic lipopeptides）等四类数十种化合物11-12。从数量上看，短短芽孢杆菌合成的主要抑菌活性物质是非核糖体肽类抗生素，其次是传统的抗菌肽13。在短短芽孢杆菌抑菌活性物质的相关研究中，一般止于分离和结构鉴定，对其合成基因和途径的预测和研究较少。因此，本研究采用阳离子交换树脂柱对B011的发酵液中的抑菌活性物质首先进行粗分离与富集，然后通过高效液相色谱法进一步分离纯化抑菌活性物质，再利用质谱与核磁波谱法解析其结构，最后根据基因组序列预测活性化合物的生物合成途径及其相关基因，以期建立抑菌活性物质和编码基因簇的对应关系，为后续解析其生物合成途径及通过合成生物学方法进行定向改造奠定基础，也为探讨抑菌活性物质在作物病害生物防治方面的应用前景提供理论指导。1材料与方法1.1菌株来源烟草青枯病菌（Ralstonia solanacearum GMI1000）由湖南农业大学植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室提供。短短芽孢杆菌 B011（Brevibacillus brevis B011）为湖南农学大学植物保护学院作物病虫害防控实验室（本实验室）自行分离、鉴定和保存的菌株。1.2仪器和材料牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、甲醇、乙腈、无水乙醇、甲酸、三氯乙酸、异丙醇、氢氧化钠和盐酸等均购自中国医药集团有限公司（北京），其中甲醇和乙腈为色谱纯，其他均为分析纯。改良NA培养基（NB固体培养基：牛肉膏1 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、琼脂粉15 g、加蒸馏水定容至1 000 mL、pH值7.2）用于培养短短芽孢杆菌菌株B011。高效液相系统：50 mm250 mm DAC Column 和LC6000型制备高效液相色谱仪（色谱仪配备P6000高压制备泵和紫外检测器），北京创新通恒科技有限公司；C18HC色谱柱、C18M开放柱，北京华谱新创科技有限公司；HPLC-QTOF/1290-6530液相质谱联用仪，安捷伦科技（中国）有限公司。1.3菌种的发酵及发酵液前处理将B011在NA培养基上划线活化，挑单菌落接种NB液体培养基，30、180 rmin-1条件下过夜培养后按5%的接种量将种子液接种于 50 L发酵罐（35 L培养基），30、160 rmin-1条件下发酵培养 48 h后放罐。B011发酵液选用截留孔径为5 kDa的中空纤维素膜过滤，同时去除菌体和分子量大于5 kDa的物质。1.4B011发酵液中抑菌活性物质的分离、纯化与鉴定将处理后的发酵液上阳离子交换树脂柱，吸附材料为D113大孔弱酸性阳树脂。洗脱体系由6个步骤组成：用3.7 molL-1 HCl溶液活化大孔吸附树脂，随后用蒸馏水冲洗至pH值呈中性；再用23倍柱体积的1.001.25 molL-1 NaOH活化树脂，随后用蒸馏水冲洗至pH值呈中性；将经中空纤维素毛细管膜过滤后的发酵液上柱，弃滤过液；用0.1%甲酸溶液冲洗大孔吸附树脂柱，弃滤过液；用5%甲酸溶液洗脱，收集洗脱液，闪蒸或喷雾干燥，即为抑菌活性物质的粗分离样品，避光低温保存备用；按第和第步骤活化树脂，进入下轮处理。1.5抑菌活性物质的纯化与鉴定将B011发酵液的粗分离冻干粉溶于去离子水超滤，上样于H型阳离子交换树脂，洗脱剂依次为去离子水、1%氨水、3%氨水。对青枯菌的抑菌活性测试结果表明，3%氨水部分为具有抑菌活性的馏分。随后将馏分冻干粉溶于工业甲醇中，抽滤后过C8M开放柱，流动相为甲醇。收集液浓缩，去离子水复溶，盐酸调pH值至中性。选择复杂度较低的组分进行活性物质的分离纯化。用分析型C18HC色谱柱进行分离，流动相为乙腈-0.2%三氟乙酸水、流速（0.65 mLmin-1）和进样量100 L、紫外检测波长为272 nm。按色谱峰分段收集具有抑菌活性的馏分；减压浓缩和冷冻干燥后得到高纯度的化合物1。流速和进样量保持不变，流动相变更为20%乙腈-0.2%三氟乙酸水，收集单色谱峰馏分，减压浓缩和冷冻干燥后得到高纯度的化合物2。以烟草青枯菌为靶标，采用滤纸片法检测化合物活性。以烟草青枯病菌为靶标菌，通过滤纸片法观察两个化合物的抑菌活性。化合物1为水溶液，化合物2为9285 期Brevibacillus brevis B011次级代谢物中抗青枯菌活性物质的纯化鉴定及生物合成基因簇分析10%二甲基亚砜水溶液（体积百分比）；化合物1号样品浓度为0.4 mgmL-1，化合物2号样品浓度为10 mgmL-1；阴性对照分别为水和10%二甲基亚砜水溶液；阳性对照为B011无菌发酵液，每张滤纸片上载样量为10 L。采用液相质谱联用仪分别对纯化获得的两个抑菌活性物质进行三重串联液质分析（liquid chromatography tandom mass spectrometry，LC-MS/MS）。采用BRUKER AVANCE III 600MHz核磁共振波谱仪（德国Bruker 公司）电喷雾质谱法（electro spray ionization mass spectrometry，ESI-MS）对2个抑菌活性物质进行核磁波谱分析（委托青岛菲优特检测有限公司开展），仪器的参数设置按说明书执行。1.6活性物质生物合成基因簇的分析本实验室前期已完成B.brevis B011基因组测序，GenBank 登录号为 CP041767。用 antiSMASH（http：/antismash.secondarymetabolites.org/）14在线对B011基因组进行次生代谢产物合成基因簇预测，将已经注释好的B011基因组序列（gbk格式）在线提交到antiSMASH数据库查询，antiSMASH 通过 blast搜索和 FPAM 结构域预测，然后与数据库中已知的次生代谢产物合成基因库进行匹配，根据基因序列的相似性和基因排列顺序进行预测。2结果与分析2.1结构鉴定2.1.1化合物1在ESI-MS：正离子模式下，该化合物的准分子离子峰 M+H+为755.440 6（图1），推测分子式为C33H58N10O10，实测值与理论值偏差仅为0.78。根据一级和二级质谱中各片段分子量的大小，推测化合物1的裂解方式如图2所示。该化合物的一维核磁共振数据归属如表1所示，其核磁共振谱数据与文献 15 的报道基本一致。综合质谱及核磁波谱测试结果，将目标化合物鉴定为伊短菌素A（edeine A），其结构如图3所示。该化合物外观为白色粉末，分子式为C33H58N10O10，分子量为754.87。2.1.2化合物2该化合物LC-MS/MS的一级及二级质谱图如图4所示。正离子模式下，准分子离子峰 M+H+的 m/z 为203.105 2，2M+H+的 m/z 为 405.202 6；