UPLC-MS_MS联用技...基二甲胺与N-亚硝基二乙胺_陈可心.pdf

第 卷第 期 年 月广 州 化 工 .联用技术测定厄贝沙坦中亚硝基二甲胺与 亚硝基二乙胺陈可心，高 珣，李军毅，李辉辉，刘钦伟，闫占宽（江苏海洋大学，江苏 连云港；江苏原创药物研发有限公司，江苏 连云港）摘 要：开发并验证了一种定量分析厄贝沙坦中 种基因毒性杂质的超高效液相色谱串联质谱（）方法。釆用 色谱柱（.，.），.甲酸水溶液甲醇为流动相梯度洗脱，大气压化学电离、正离子平行反应监测模式（）进行检测，结果显示 亚硝基二甲胺（）和 亚硝基二乙胺（）在.浓度范围内线性关系良好，检测限（）为.、.，供试品加标溶液回收率为 。所建立的方法灵敏、准确，可满足对厄贝沙坦中 种 亚硝胺类基因毒性杂质的检测。关键词：亚硝基二甲胺；亚硝基二乙胺；基因毒性杂质；厄贝沙坦；液相色谱串联质谱法中图分类号：文献标志码：文章编号：（）第一作者：陈可心（），女，硕士研究生，主要从事药学和药物分析研究。通讯作者：闫占宽（），男，副高级工程师，主要从事药学和工业分析研究。，（，；.，.，）：（），（）（）（.，.）.，（）.，.，.：；高血压是心脑血管疾病最主要的危险因素，也是我国最常见、最具普遍性和代表性的慢性病之一，其治疗往往伴随着终身服药。血管紧张素受体阻断药（）又称沙坦类药物，是目前常用的高血压一线药。研究表明此类药物除具降压机制外还具有心血管保护、肾脏保护、降低 型糖尿病发病风险等靶器官保护作用，不良反应极少，患者耐受性好。年，浙江华海缬沙坦原料药中检出了 和 引发了多种缬沙坦药品召回。随后，印度 公司生产的氯沙坦和 公司生产的厄贝沙坦中也检出了超过限度的 基因毒性杂质。由于“缬沙坦事件”的发酵，欧盟将审查范围扩展至所有沙坦类药物及其原料药，美国食品药品监督管理局（）发布安全警告，多批次问题产品均被召回，针对此类基因毒性杂质更明确的检验检测标准陆续颁布。年，欧洲药典委员会（）与人用药品委员会（）共同决定给制造沙坦类物质的公司一个过渡期。过渡期内，采用现行国际标准设定限量，审查制造工艺并进行必要的更改，以避免亚硝胺杂质的产生。过渡期之后，实施“无亚硝胺”概念，即亚硝胺类杂质需.（此限度于 年 月实施）。亚硝胺杂质中的 和 都属于 通则中第一类已知诱变性和致癌性的物质，其分子量小，含量极微，控制限度比较低，因此对检测方法的灵敏度提出了很高的要求。目前国家药典委员会（）、及法国国家药品和保健品安全署（）等机构公布的、检测方法主要有、法等。本研究以.为杂质限度，采用液相第 卷第 期陈可心，等：联用技术测定厄贝沙坦中 亚硝基二甲胺与 亚硝基二乙胺 色谱联用质谱技术，建立了一种同时检测厄贝沙坦原料药中两种基因毒性杂质的方法，以期为评估沙坦类药物中亚硝胺类杂质风险提供新的方法参考。实 验.仪器与试剂 二维超高效液相色谱高分辨质谱联用仪（含 高效液相色谱仪、质谱仪、电喷雾离子化接口），赛默飞世尔科技有限公司 ；软 件 和 分 析 软 件；十万 分 之 一 电 子 天 平，德 国 赛 多 利 斯；纯水仪，德国默克密理博；艾本德 高速离心机，艾本德；双频超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司；移液枪（），艾本德；移液枪（），艾本德；色谱柱（.，.），安捷伦。厄贝沙坦（规格：原料药），江苏恒瑞医药股份有限公司；亚硝基二甲胺（含量.），中国食品药品检定研究院；亚硝基二乙胺（含量.），中国食品药品检定研究院；甲醇（），默克；甲酸（），；去离子水，公司自制。.实验方法.色谱条件色谱柱：，.，.；流速：.；柱温：；进样体积：；流动相 为体积分数.甲酸水溶液，流动相 为甲醇，梯度洗脱程序：，。.质谱条件离子源类型：大气压化学电离源（），鞘气流速 ，辅助气流速，电晕放电电流.，离子传输管温度在，电压 ，蒸发温度 。采集方式：正离子平行反应监测（）模式，方法参数见表。溶剂进入质谱时间 ，杂质 定性离子（母离子）与定量离子（子离子）的质荷比（）分别为.和.，杂质 定性离子与定量离子均为母离子，质荷比（）为.。表 方法 名称质荷比极性扫描起止时间 碰撞能分辨率隔离窗口.定量离子。.溶液配制稀释液：甲醇:水:。标准溶液对照品溶液：精密称取 及 对照品适量，置于同一 容量瓶中，加甲醇溶解并定量稀释制成每 中约含.的对照品贮备液。再进一步用稀释液定量稀释制成 对照品贮备液 和.对照品溶液。系列浓度线性溶液：取对照品溶液适量，用稀释液定量稀释制成浓度为.、.的线性、溶液。对照品溶液作线性 溶液。取对照品贮备液 适量，用稀释液定量稀释制成浓度为.、.的线性、溶液。系列回收率贮备液：取对照品贮备液 适量，以甲醇为稀释剂，分 别 稀 释 制 成 浓 度 约.、.、.的、回收率贮备液。供试品溶液精密称取厄贝沙坦原料药约 ，置 离心管中，精密加入甲醇.，超声 ，再精密加入超纯水.，摇匀，超声振摇 ，再用离心机以 ，离心 ，用.尼龙膜过滤，取续滤液作供试品溶液。结 果.专属性试验精密称取厄贝沙坦原料药约 ，按“.”项方法，加 回收率贮备液配制 供试品加标溶液。分别进样空白溶液、供试品溶液、对照品溶液、供试品加标溶液，结果见图。和 的出峰位置分别在.和.。确定在所建立的操作条件下，空白溶液和供试品溶液对 和 测定无干扰。广 州 化 工 年 月图 色谱图.线性和范围取“.”项下系列浓度线性溶液 各进样 次，以 和 的浓度（）为横坐标，峰面积平均值（）为纵坐标，进行线性回归，得 的线性回归方程为（.），的线性回归方程为 .（.）。表明在测定范围内，和 的峰面积与浓度成良好的线性。.检测限与定量限采用直观法测定 和 的定量限，和限度即为定量限，信噪比法测定 和 的检测限，稀释对照品溶液至一定浓度，信噪比（）为 的溶液为检测限溶液。结果显示（数据见表），和 检测限为.（.）、.（.），相对标准偏差（）为.、.，定量限为.（.）、.（.），均远低于限度对应的检测量.（.）。表 和 的定量限与检测限数据 序号面积 面积.平均值.精密度和准确度试验.进样精密度取“.”项下对照品溶液连续进样 次，计算对照品溶液中 和 峰面积的 分别为.和.，表明仪器精密度良好。.重复性精密量取“.”项下对照品溶液 于 容量瓶中，用稀释液定容，摇匀，作为灵敏度溶液（约.）。用 回收率贮备液平行配制 份 供试品加标溶液。供试品加标溶液中 和 含量的 分别为.、.，表明本方法稳定、重复性良好。.准确度精密称取供试品 ，合 份，按“.”项操作，制备 个浓度的系列供试品加标溶液和供试品溶液（平行配制 份）。分别进样对照品溶液、灵敏度溶液、份供试品溶液、份 供试品加标溶液、份 供试品加标溶液、份供试品加标溶液。表 结果显示，供试品加标溶液回收率均在，方法准确可靠。表 加样回收率结果 浓度点理论加入量（）实际测得量（）回收率 理论加入量（）实际测得量（）回收率 本底浓度（）.未检出.溶液稳定性选取、的进样时间点，分别进样照品溶液、供试品溶液和 供试品加标溶液。结果见表，显第 卷第 期陈可心，等：联用技术测定厄贝沙坦中 亚硝基二甲胺与 亚硝基二乙胺 示空白溶液、对照品溶液、供试品溶液和 供试品加标溶液，室温放置 ，、峰面积的 均.。表明溶液在 内稳定性良好。.耐用性在正常色谱质谱条件的基础上，微调检测方法中各参数的值，按照“.”项下方法分别配制对照品溶液、灵敏度溶液、供试品加标溶液（平行配制 份），考察结果显示（表），供试品加标溶液中 和 含量的 均.，表明耐用性良好。表 耐用性测定结果 序号条件加标供试品含量（）正常条件.更换同型号色谱柱.续表 流速.流速.柱温箱温度 .柱温箱温度 .平均值.样品含量测定取连续的 批次厄贝沙坦（原料药），分别按“.”项方法配制供试品溶液，按“.、.”项操作条件进行含量测定，两种 亚硝胺类基因毒性杂质均未检出，批次样品的典型质谱图见图。图 样品含量测定的典型质谱图.讨 论.色谱条件的选择 版药典液相色谱条件采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，本研究实验选择装填了高性能的微粒 填料 快速分离色谱柱（.，.）。其特殊的 硅胶颗粒（类）可以降低或消除碱性和强极性化合物的强吸附作用，分析、等碱性化合物时可得到卓越的峰形。目前使用液相色谱质谱联用仪检测 亚硝胺类基因毒性杂质的方法多数以甲醇水作为流动相，添加供给 的甲酸试剂以促进离子化，选定体积分数.甲酸水溶液甲醇为流动相。调试洗脱梯度保证良好的专属性并优化分析时间。.质谱条件的选择大气压化学电离源（），适用于具有一定挥发性，热稳定，中低极性的化合物离子化，因此离子源选定 源。确定 源最佳使用流速.后，在推荐值内对离子传输管温度、蒸发温度、鞘气流速、辅助气流速等参数进行调试。目标物结构中均含有碱性氮原子，选择正离子 模式采集，电晕放电电流设为 ，电压 ，根据离子响应强度确定最佳离子源区参数。溶剂进入质谱时间设为 可有效避免高浓度主药洗脱液污染质谱，确保分析方法灵敏度。结 论本研究建立并验证了检测厄贝沙坦原料药中基因毒性杂质 和 含量的 方法。各项结果均满足 广 州 化 工 年 月中华人民共和国药典 年版指导原则：分析方法验证指导原则接受标准。运用该方法检测连续三批次厄贝沙坦原料药，均未检出两种 亚硝胺类基因毒性杂质。所建立的厄贝沙坦原料药中两种 亚硝胺杂质的检测方法灵敏、准确、稳定，应用可靠，有助于进一步强化厄贝沙坦原料药中 亚硝胺类基因毒性杂质的市场监管，实现药品“无亚硝胺”，保障药品质量安全。参考文献，.：（），（）：.，.，（）：.吕国飞.厄贝沙坦氢氯噻嗪片联合美托洛尔治疗慢性充血性心衰的效果观察中国实用医药，（）：.陈莹莹.胺碘酮与厄贝沙坦联用治疗心力衰竭并心律失常的临床研究黑龙江医药，（）：.，（），.胡建娥.雷公藤多苷联合厄贝沙坦治疗 肾病的效果分析吉林医学，（）：.杨成林，王晓莉.厄贝沙坦治疗原发性高血压早期肾损害的效果及安全性临床合理用药杂志，（）：.钟庆荣，钟娟.血管紧张素受体拮抗剂治疗糖尿病肾病机制研究进展中国社区医师，（）：.刘莉，罗鹏，周田田，等.厄贝沙坦对高血压合并 型糖尿病大鼠胰岛素抵抗 信号通路的影响中国临床解剖学杂志，（）：杨兴然.硝苯地平辅助厄贝沙坦治疗糖尿病合并高血压的临床研究海峡药学，（）：.林海龙，王旭开，王其梗，等.血管紧张素转换酶抑制剂与血管紧张素受体拮抗剂治疗高血压：有无优劣之分？如何选择？中华高血压杂志，（）：.：.，.，（）：.，.：，：.：.（）（）：.国家药典委员会.关于缬沙坦国家标准修订稿的公示（第二次）：.（）（）：.：.：.（）：.（）：.国家药典委员会.中华人民共和国药典 版北京：中国医药科技出版社，：.汪锡佳.盐酸雷尼替丁胶囊的质量研究成都：成都大学，.裴后猛.厄贝沙坦中亚硝胺类基因毒性杂质及其前体物亚硝酸盐的检测方法学研究 青岛：青岛大学，.（上接第 页）宋应金，刘蕊，于宁，等.石墨烯在润滑油（脂）中的应用哈尔滨商业大学学报（自然科学版），（）：.，.，：.，.，.