pH-DO组合调控策略提高...霉菌ε-聚赖氨酸的生物合成_吴梦萍.pdf

研究报告2023 年第49 卷第5 期(总第473 期)9DOI:10 13995/j cnki 11 1802/ts 031500引用格式:吴梦萍，王靓，张建华，等 pH-DO 组合调控策略提高小白链霉菌-聚赖氨酸的生物合成 J 食品与发酵工业，2023，49(5):9 17 WU Mengping，WANG Liang，ZHANG Jianghua，et al Enhancing the epsilon-poly-L-lysine biosynthesis of Strep-tomyces albulus by a pH-DO combined regulation strategy J Food and Fermentation Industries，2023，49(5):9 17pH-DO 组合调控策略提高小白链霉菌-聚赖氨酸的生物合成吴梦萍1，2，王靓1，2，张建华1，2，张宏建1，2，陈旭升1，2*1(江南大学，生物工程学院，江苏 无锡，214122)2(工业生物技术教育部重点实验室(江南大学)，江苏 无锡，214122)摘要-聚赖氨酸(-poly-L-lysine，-PL)是一种主要由小白链霉菌生产的广谱性天然食品防腐剂，具有广泛的工业应用价值。该研究对-PL 高产菌 Streptomyces albulus WG-608 在 5 L 罐发酵不同阶段的 pH 与溶解氧(dissolved oxygen，DO)进行了系统优化，并构建了一种新的 pH-DO 组合调控策略。该策略将发酵分为 2 个阶段:第一阶段 DO 被控制在 40%，pH 维持在 4 0;第二阶段 DO 被控制在 20%，pH 维持在 4 3。经 240 h 的补料-分批发酵，WG-608 的-PL 产量与平均比生产速率为(68 77 2 53)g/L 和(2 33 0 08)d1，比对照策略分别提高了 28 23%和 12 02%。为进一步探究该策略提高 WG-608-PL 产量的细胞生理代谢差异的原因，对不同时期细胞的关键酶活力、呼吸链活力和辅因子水平等进行了分析。结果表明，葡萄糖消耗、中心碳代谢途径、L-赖氨酸生物合成途径、呼吸链活性和胞内辅因子的增强是 pH-DO 组合调控策略增强-PL 产量的原因。总之，pH-DO 组合调控策略是一种通过增强碳代谢和能量代谢提高-PL 产量的有效方法。该方法的建立为其他链霉菌发酵生产-PL 提供了新的思路。关键词-聚赖氨酸;小白链霉菌;食品防腐剂;pH;溶解氧第一作者:硕士研究生(陈旭升教授为通信作者，E-mail:chenxs jiangnan edu cn)基金项目:国家重点研发计划项目(2020YFA0907700);江苏省自然科学基金项目(BK20191332，BK20190585);国家自然科学基金项目(31901622，31671846)收稿日期:2022-03-09，改回日期:2022-04-29-聚赖氨酸(-poly-L-lysine，-PL)是一种天然均聚氨基酸，由 25 35 个 L-赖氨酸(L-lysine，L-lys)单体通过-COOH 和-NH2脱水缩合而成1。作为一种广谱的阳离子抗菌肽，-PL 可以破坏革兰氏阳性/阴性细菌、酵母菌等真菌的细胞包膜结构，从而抑制微生物的生长。目前，-PL 已被日本、韩国、美国和中国等国家批准作为食品防腐剂。此外，-PL 具有良好的水溶性、对环境与人类无公害以及可生物降解性等极具商业价值的特性，因此被广泛应用于食疗剂、干扰剂、酶保护剂、药物载体等领域2。然而，作为一种主要由链霉菌生产的次级代谢产物，-PL 产量较低，限制了其工业化生产及商业应用。pH 和溶解氧(dissolved oxygen，DO)是影响-PL发酵最主要的限制因素。一般来说，pH 可以通过改变细胞膜的表面电荷来影响营养物质的有效性和酶活性，从而影响细胞活力3。KAHA 等4 发现-PL产生的最适 pH 为 4 0，而 pH 5 对细菌菌丝生长更有利。基于此，该团队建立了两阶段 pH 调控策略，将产量从 5 7 g/L 提高到 48 3 g/L，提高了 7 47 倍。EN 等5 发现短时的酸性 pH 冲击可以促进菌体快速地生长及-PL 的大量合成，随后建立了 pH 冲击工艺，将-PL 产量提高了 52 5%，达到 54 70 g/L。此外，由于-PL 发酵为好氧发酵且发酵液的黏度较高，限制了 DO 在扩大发酵时的传递效率。为了解决这个问题，XU 等6 在补料分批发酵过程中，外源添加了氧载体(0 5%正十二烷)，提高了发酵液中 DO浓度，将产量提高了 31 6%。随后，该团队通过过表达透明颤菌的血红蛋白基因(vgb)，提高了 Streptomy-ces albulus PD-1 发酵的氧气摄取能力，将-PL 提高至 34 2 g/L，增加了 50%7。然而，以往研究主要集中在-PL 发酵前期(前 36 h)对 pH 和 DO 的单独优化，很少有策略对 pH 与 DO 进行同时优化。在前期的工作中，本团队经过多轮诱变与核糖体工程选育，筛选出一株高产菌 Streptomyces albulusWG-608，其 摇 瓶-PL 产 量 较 出 发 菌 提 高 了42.3%8。该菌株在发酵进入稳定期后，出现了葡萄糖消耗速度大幅下降、菌体生长受到明显抑制的现象，进而影响了-PL 的单位菌体合成能力。基于此，本研究开发了一种新的 pH-DO 组合调控策略，分阶段对 pH 和 DO 进行系统优化，显著提高了 WG-608食品与发酵工业FOOD AND FEMENTATION INDUSTIES102023 Vol.49 No.5(Total 473)的单位菌体合成能力与-PL 产量。随后，研究了WG-608 的细胞生理变化，包括关键酶活性、呼吸链活性和胞内核苷酸水平，以阐明 pH-DO 组合调控策略对细胞代谢的影响。1材料与方法1 1实验材料1 1 1菌种Streptomyces albulus WG-608 由出发菌 S albulusM-Z18 经多轮诱变及核糖体工程获得，并由本实验室保藏9。1 1 2培养基与溶液种子发酵培养基(g/L):葡萄糖 40，酵母粉 8，(NH4)2SO45，K2HPO42，MgSO47H2O 0 5，FeSO47H2O 003，ZnSO47H2O 004，用 NaOH 调 pH 至7.2。发酵 培 养 基(g/L):葡 萄 糖 60，酵 母 粉 8，(NH4)2SO45，K2HPO42，MgSO47H2O 0 5，FeSO47H2O 0 03，ZnSO47H2O 0 04，消泡剂 0 2，pH 6 8。流加培养基(g/L):葡萄糖 750，氨水 12 5%(体积分数，下同)，(NH4)2SO4375，消泡剂 100。100 mmol/L Tris-HCl:24228 g Tris 和00308 g 二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT，1 mmol/L)溶于 20%甘油并定容至200 mL，再用浓 HCl 调 pH 至7.5。1 1 3主要试剂与仪器葡萄糖(优级纯)，山东西王药业有限公司;酵母粉，Oxoid 公司;其他试剂，均为分析纯，国药化学试剂有限公司;ATP、NAD(P)H 试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司;碘硝基氯化四氮唑蓝(iodonitrotet-razolium chloride，INT)，上海源叶生物科技有限公司;BCA 蛋白测定试剂盒，宝日医生物技术(北京)有限公司。5 L 发酵罐，上海保兴生物设备有限公司;UV-2100 分光光度计，优尼科仪器有限公司;AB204-N 分析天平，瑞士梅特勒公司;GNP-9160 恒温培养箱，上海光都仪器设备有限公司;3K15 高速冷冻离心机，德国Sigma 公司;HYL-C 组合式摇床，太仓市强乐设备有限公司;SW-CJ-1FD 超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司;SM-650D 超声破碎仪，南京舜玛仪器设备有限公司;Biotek 多功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司。1 2实验方法1 2 1培养条件一级种子液培养，取孢子接种于种子培养基，置于 30，200 r/min 摇床培养 24 h。二级种子液培养，将 6 4 mL 种子液接入含 80 mL种子培养基的 500 mL 锥形瓶中，30，200 r/min 培养 24 h。5 L 发酵罐-PL 恒定 pH 补料分批发酵，在 5 L罐中装入 3 2 L 发酵培养基灭菌，设置发酵罐温度30，初始转速 200 r/min，曝气率 1 14 vvm，pH6.8，共发酵240 h。接种240 mL 种子液入发酵罐，随着发酵的进行，发酵 pH 自然下降，当 pH 降至 4 0时，补加 12 5%的氨水溶液将 pH 控制在 4 0，直至发酵结束。通过调整转速和通气量，使 DO 尽量维持在 30%，当发酵液葡萄糖浓度 10 g/L 时，根据葡萄糖的消耗速率设定补料速率，补加的葡萄糖溶液质量浓度为 750 g/L。当罐内的 NH4+-N 质量浓度低于0 2 g/L 时，补加375 g/L 的(NH4)2SO4溶液，使其维持在 0 1 0 5 g/L，直至发酵结束。1 2 2分析方法1 2 2 1发酵过程参数测定方法葡萄糖浓度测定方法:将发酵液样品离心后取一定量的上清液，使用生物传感分析仪(biosensoranalyzer，SBA)缓冲液稀释 100 倍，充分混匀后进行检测并读数;NH4+-N 浓度测定方法:取发酵液离心后的上清液，稀释一定比例后，通过靛酚蓝反应法测定9。发酵液的-PL 浓度由甲基橙比色法测定10;菌体干重(dry cell weight，DCW)由滤纸差量法测定11。1 2 2 2生理参数测量粗酶液的制备参照王靓12 的方法加以改进:取发酵液 1 000 g 离心 5 min，弃上清液;0 2 g/L KCl溶液洗涤 3 次，弃上清液重悬于 100 mmol/L Tris-HCl(pH 7 5)缓冲液;超声破碎仪在 60%功率下破碎细胞 20 min(工作 2 s，停 2 s)，12 000 g 离心 20 min，上清液即为粗酶液，蛋白浓度测定参照 BCA 蛋白测定试剂盒。酶活力测定方法:(1)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glu-cose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH)活性测定参照 TANG 等13 的方法并加以改进，100 mmol/L Tris-HCl 缓冲液 350 L，0 4 mmol/L NADP+18 L，5 mmol/L 葡萄糖-6-磷酸 7 L，粗酶液 50 L;定义1U 为 30 条件下每分钟 1 mol/L NADP+转化为NADPH 所需的酶量。(2)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC)活性测定参照 BAMWELL 等14 的方法并加以改进，100 mmol/LTris-HCl 缓冲液 235 L，1 mmol/L 乙酰 CoA 25 L，研究报告2023 年第49 卷第5 期(总第473 期)1140 mmol/L MnSO450 L，100 mmol/L NaHCO350 L，1 5 mmol/L NADH 50 L，20 mmol/L 磷酸烯醇式丙酮酸 20 L，500 U/mL 苹果酸脱氢酶 10 L，粗酶液10 L，定义 30 条件下反应 1 min 催化生成 1 molNAD+所需的酶量为 1 个酶活力单位;(3)柠檬酸合酶(citrate synthase，CS)活力参照 MUAKAMI 等15 的 方 法，100 mmol/L Tris-HCl 缓 冲 液 235 L，6 7 mmol/L 5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)5，5-di-thiobis-(2-nitrobenzoicacid)，DTNB 10L，200 mmol/L 草酰乙酸二钠 5 L，1 mmol/L 乙酰 CoA25 L，定义