miR-9靶向调控PTEN...8+宫颈癌细胞凋亡中的作用_卢庭婷.pdf

病 毒 学 报CHINESE JOURNAL OF VIROLOGYVol.39No.2March 2023第 39 卷 第 2 期 2 0 2 3 年 3 月miR9 靶向调控 PTEN 在 HPV16+及 HPV18+宫颈癌细胞凋亡中的作用卢庭婷，陈基强，黄艳，张柯媛*（广西卫生职业技术学院，南宁 530021）摘要：研究微小 RNA9（microRNA9，miR9）靶向调控人第 10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源蛋白（Recombinant phosphatase and tensin homolog，PTEN）在 人 乳 头 瘤 病 毒（Human papilloma virus，HPV）16+及HPV18+宫颈癌细胞凋亡中的作用。收集宫颈癌组织及正常宫颈组织，培养 HPV16+SiHa细胞、HPV18+HeLa细胞、HPV 阴性 C33A 细胞及正常宫颈上皮 H8细胞，检测 miR9、PTEN 的表达水平。SiHa细胞和 HeLa细胞进行分组转染后检测增殖抑制率、凋亡率、PTEN 及 miR9表达水平。结果显示高危型 HPV 阳性及阴性的宫颈癌组织中 miR9的表达水平高于正常宫颈组织、PTEN 的表达水平低于正常宫颈组织（P0.05）且高危型 HPV 阳性宫颈癌组织中 miR9、PTEN 表达的变化更显著；SiHa细胞、HeLa细胞中 miR9的表达水平高于 C33A 细胞和 H8细胞、PTEN 的表达水平低于 C33A 细胞和 H8细胞（P0.05）；敲低 miR9表达后，SiHa细胞、HeLa细胞的 PTEN 表达水平、增殖抑制率、凋亡率均升高（P0.05）；敲低 PTEN 的表达削弱敲低 miR9 表达的作用（P0.05）。敲低 miR9通过增加 PTEN 表达的方式促进 HPV16+及 HPV18+宫颈癌细胞凋亡，miR9靶向 PTEN 可能参与高危型 HPV感染导致宫颈癌的发生。本研究通过临床样本检测及细胞实验初步揭示了 miR9靶向调控 PTEN 在高危型 HPV感染导致宫颈癌发病的分子机制，在 HPV 感染的宫颈癌细胞中 miR9靶向抑制 PTEN 的表达并促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，进而促进了肿瘤的发生发展。关键词：miR9；PTEN；宫颈癌；高危型人乳头瘤病毒；凋亡中图分类号：R373.9 文献标识码：A 文章编号：10008721（2023）02042709DOI：10.13242/ki.bingduxuebao.004289宫颈癌的发病率居女性生殖系统恶性肿瘤的首位1，2，高危型人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）感染是宫颈癌发病的明确危险因素3。微小RNA（microRNA，miR）是一种在转录后水平发挥基因表达调控作用的非编码小分子 RNA，高危型HPV 感染可能通过调控宿主细胞内 miR 表达的方式改变下游癌基因的表达，进而导致宿主细胞发生恶变4，5。人第 10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白 同 源 蛋 白（Recombinant phosphatase and tensin homolog，PTEN）是已知具有明确抑癌作用的分子，对癌细胞的增殖具有抑制作用、凋亡具有促进作用。一项芯片检测及生物信息学分析证实 miR9在宫颈癌的发生发展中起促癌作用，靶向抑制 PTEN表达、抑制癌细胞凋亡是其发挥抑癌作用的相关机制6。但目前关于 miR9靶向调控 PTEN 参与宫颈癌发生发展的相关研究仍停留在生物信息学分析的层面，缺乏直接的细胞实验证据。HPV16 和 HPV18 是 最 常 见 的 两 类 高 危 型HPV，有研究报道高危型 HPV 的 E6/E7 基因调控宫颈癌细胞中多种 miR 的表达，敲低 E6/E7 基因显著抑制 miR9的表达7，提示 miR9可能受到高危型HPV 感染的调控并参与高危型 HPV 感染导致宫颈癌的发生。但目前尚缺乏高危型 HPV 感染导致宫颈癌发生的基础研究证据。因此，本研究将通过宫颈癌临床样本检测、宫颈癌细胞实验等手段分析miR9 靶向调控 PTEN 在 HPV16+及 HPV18+宫颈癌细胞凋亡中的作用，旨在初步揭示 miR9 在高危型 HPV 感染导致宫颈癌发生发展中的生物学作用及机制。材料与方法1 样本选择手术切除的宫颈癌组织以及因子宫肌瘤行子宫切除的正常宫颈组织。宫颈癌组织共 75例，均经术后病理确诊且术前未接受过放化疗；正常宫颈组织共 48例，经术后病理确认组织性质。本研究取收稿日期：20220616；接受日期：20221006基金项目：广西壮族自治区教育厅科学研究项目（项目号：KY2016YB740），题目：广西女性 HLADR 基因多态性与宫颈癌易感性的关联研究作者简介：卢庭婷（1979），女，副教授，从事分子生物学研究，Email：通讯作者：张柯媛（1981），女，副教授，从事药理学及医学微生物学研究，Email：开放科学（OSID）病 毒 学 报39卷得医院伦理委员会批准，取得患者知情同意。2 细胞株HPV16+SiHa 细 胞、HPV18+HeLa 细 胞、HPV 阴性 C33A 细胞及正常宫颈上皮 H8 细胞，浙江美森细胞科技公司。3 miR模拟物及抑制物、siRNA阴性对照（NC）miR模拟物（5 TAGCTAGTCAGTCGTTAC3）、miR9 模拟物（5ATGCTATGCTAGCATCTA3）、阴 性 对 照（NC）miR抑制物（5TGCTATCGATGATCGGTAT3）、miR9抑制物（5ATAGCGTAGCTAGCTAAT3），NC siRNA（5 ATCGATGCTAGCTACTA 3）、PTEN siRNA（5TACGATGCTASGCTAGC3），上海吉玛生物公司。4 试剂miR 提取分离试剂盒、miR cDNA 第一链合成试剂盒、miR 荧光定量检测试剂盒（SYBR Green），北 京 天 根 生 化 公 司；PTEN 特 异 性 一 抗（货 号ab267787），美国 Abcam 公司；CCK8 细胞增殖检测试剂盒、TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒，上海碧云天公 司；双 荧 光 素 酶 报 告 基 因 及 检 测 系 统，丹 麦Promega公司。5 仪器紫外凝胶成像仪，济南童鑫生物科技公司；细胞培养箱，美国 Thermo 公司；荧光定量 PCR 仪，美国ABI公司；显微镜，日本 Nikon公司；凝胶电泳系统，美国 Biorad公司；凝胶成像系统，上海勤翔公司。6 宫颈癌组织中高危型 HPV的检测提 取 宫 颈 癌 组 织 中 基 因 组 DNA，分 别 对HPV16 基因及 HPV18 基因进行 PCR 扩增，反应程序：95 5 min 后 95 1 min、55 30 s、72 30 s，重复 40 次后得到 PCR 产物。在 2%琼脂糖凝胶中对PCR 产物进行电泳，在紫外凝胶成像仪显影得到PCR 产物的条带，HPV16 基因的 PCR 产物长度为152 bp、HPV18 基 因 的 PCR 产 物 长 度 为 471 bp，HPV16 基 因 或 HPV18 基 因 阳 性 判 断 为 高 危 型HPV感染。7 细胞培养、分组及转染SiHa 细胞、HeLa 细胞、C33A 细胞、H8 细胞在含有 10%胎牛血清的培养基中贴壁培养，每 2d 换液 1次，常规传代后用于 miR9、PTEN表达的检测。传代的 SiHa细胞、HeLa细胞接种在培养板内，待细胞密度融合至 80%90%时进行分组转染。为研究 miR9 的生物学作用，分别对 miR 进行敲低和过表达，细胞分组如下：miRNC 组：转染 NC miR模拟物；miR9组：转染 miR9模拟物；miRNC 敲低组：转染 NC miR 抑制物；miR9 敲低组：转染 miR9 抑制物；为研究 PTEN 在敲低 miR9 抑制增殖、促进凋亡中的作用，细胞分组如下：miRNC 敲低+siNC 组：共转染 NC miR 抑制物及 NC siRNA；miR9敲低+siNC组：共转染 miR9抑制物及 NC siRNA；miR9 敲低+siPTEN 组：共转染 miR9抑制物及 PTEN siRNA。miR模拟物、miR抑制物、siRNA 的终浓度均为 50 nmol/L。每组设置 5个复孔，连续转染 24 h。8 组织及细胞中 miR9表达的检测采用 miR 提取分离试剂盒提取宫颈癌组织、正常宫颈组织、SiHa 细胞、HeLa 细胞、C33A 细胞、H8细胞中的 miR，采用 miR cDNA 第一链合成试剂盒将 miR 反 转 录 为 cDNA，采 用 miR 荧 光 定 量 检 测cDNA 中 miR9 的表达水平，检测方法为荧光定量PCR，反应体系为 cDNA 2 L、预混液 10L、目的基因miR 9的特异性上游引物（5 TGAGTCGATGCTAGCTAG3）或内参基因 U6的特异性上游引物（5AGAGTAGCCGTATGTCGAT3）0.6L、试剂盒中的通用下游引物0.6 L、去离子水补足至 20.0 L。在荧光定量 PCR 中进行反应，程序为 95预变性10min，而后 95 10 s、60 34 s 并重复 40 个循环。完成反应后得到 PCR 循环曲线及循环阈值（Ct），以U6为内参，按照公式 2Ct计算 miR9的表达水平。9 组织及细胞中 PTEN表达的检测采用组织裂解液提取宫颈癌组织、正常宫颈组织的蛋白，采用细胞裂解液提取 SiHa细胞、HeLa细胞、C33A 细胞、H8 细胞中的蛋白，蛋白定量后将含有 20 g 蛋白的样本在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，分离不同分子量的蛋白后电转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶室温封闭 1h，PTEN 一抗（1 1 000）或 actin 一抗（1 5 000）4孵育过夜。而后，孵育二抗（1 2 000）1h，将硝酸纤维素膜放入凝胶成像系统、采用化学发光法对蛋白条带进行显影，用 Image J 软件扫描条带、得到灰度值，以 actin 为内参、计算 PTEN的表达水平。10 细胞增殖水平的检测采用 CCK8 法检测细胞增殖水平，按照试剂盒说明书对各组细胞进行操作后在酶标仪上检测490nm 波长的吸光值 A490nm，按照（对照孔 A490nm实验 4282期卢庭婷，等.miR9靶向调控 PTEN在 HPV16+及 HPV18+宫颈癌细胞凋亡中的作用孔 A490nm）/对照孔 A490nm100%计算增殖抑制率。11 细胞凋亡水平的检测采用 TUNEL 法检测细胞凋亡水平，按照试剂盒说明书对各组细胞进行操作后在荧光显微镜下观察 TUNEL 阳性染色和 DAPI阳性染色情况并对阳性细胞进行计数，按照 TUNEL 阳性细胞数/DAPI阳性细胞数100%计算细胞凋亡率。12 双荧光素酶报告基因检测将 PTEN 报告基因转染进入 SiHa细胞及 HeLa细胞，24h 后按照 miRNC 组和 miR9 进行转染，分别转染 NC miR 模拟物及 miR9 模拟物，继续转染24h后采用双荧光素酶报告基因检测系统检测萤火虫的荧光活力及海肾的荧光活力，计算比值得到双荧光素酶报告基因质粒的荧光值。13 统计学处理采用 SPSS23.0 软件对实验数据进行统计学处理，计量资料以均数标准差表示，采用单因素方差分析进行 4 组间比较，有统计学差异后进一步进行LSDt法两两比较；采用独立样本 t检验进行 2组间比较，P0.05为差异有统计学意义。结 果1 高危型 HPV 阳性宫颈癌、高危型 HPV 阴性宫颈癌、正常宫颈中 miR9、PTEN表达水平的比较为初步认为 miR9及 PTEN 在宫颈癌发生中的作用及其与高危型 HPV 感染的关系，收集宫颈癌组织及正常宫颈组织，对 miR9、PTEN 的表达进行检测和分析可知：高危型 HPV 阳性宫颈癌、高危型HPV 阴性宫颈癌中 miR9 的表达水平高于正常宫颈组织，PTEN 的表达水平低于正常宫颈组织，差异有统计学意义（P0.05）；高危型 H