LncRNA_MAFG-A...癌细胞增殖与凋亡的作用研究_张俊.pdf

：引用格式：张俊，张春梅，周园红，等 、对宫颈癌细胞增殖与凋亡的作用研究巴楚医学，（）：基金项目：国家自然科学基金项目（：，）；宜昌市科技攻关项目（：，）作者简介：张俊，男，硕士，主治医师，研究方向为妇科恶性肿瘤的临床与基础研究。：通信作者：罗幼珍，女，主任医师，研究方向为妇科恶性肿瘤的综合治疗。：、对宫颈癌细胞增殖与凋亡的作用研究张俊张春梅周园红刘倩罗幼珍（三峡大学 第一临床医学院 宜昌市中心人民医院妇科，湖北 宜昌 ；中国医科大学 附属盛京医院妇科，辽宁 沈阳 ）摘要：目的目的：分析 、在宫颈癌细胞增殖与凋亡中的作用。方法方法：检测正常宫颈组织、宫颈癌组织与宫颈癌 细胞株中 与 表达水平。、转染宫颈癌 细胞，检测细胞活力、细胞凋亡、凋亡相关蛋白和增殖相关蛋白的表达；双荧光素酶法检验 与 的靶向作用关系。结果结果：宫颈癌组织和 细胞中 与 表达高于正常宫颈组织和正常宫颈上皮细胞（均）。与 组 相 比，组 、蛋 白 表 达 降 低，而 、蛋白表达升高（均）。与 组相比，组 、蛋白表达减少，、蛋白表达增加（均）。双荧光素酶检测显示，可靶向调控 。结论结论：可通过靶向调控 调节宫颈癌细胞的增殖与凋亡。关键词：宫颈癌；凋亡；增殖中图分类号：文献标志码：文章编号：（）开放科学（资源服务）标识码（）：o o o o o o o （，；，）：o ：，：，（），巴楚医学 年第卷第期 ，（），（）o o：o ；宫颈癌是临床常见妇科疾病，主要发病原因是人乳头状瘤病毒（，）持续感染。现代研究认为宫颈癌恶性病变、预后结果等与长链非编码（，）异常表达密切相关，宫颈癌的侵袭、转移、复发等与微小（，）相关，可作为评价宫颈癌预后、治疗效果的指标。重组人 肌腱膜纤维肉瘤癌基因 反义 （，）多在非小细胞肺癌中表达上调，属于 的一种。有研究指出，和 表达上调参与宫颈癌的转移与侵袭。但 、异常表达对宫颈癌细胞凋亡和增殖的影响尚不明确。本研究拟 分析 宫颈癌 及 细胞 中 、表达，并探讨其在 细胞增殖、凋亡中的作用，现报道如下。资料与方法研究对象收集 年月 年 月我院收治的 例宫颈癌患者作为观察对象，手术取患者正常宫颈组织与宫颈癌组织作为研究标本。纳入标准：术前月未进行放化疗，对研究知情，病理组织学检查确诊为宫颈鳞状细胞癌。排除标准：合并严重心、肝、肾脏器功能不全者，合并其他恶性肿瘤疾病。本研究经医院伦理委员会批准。研究方法仪器与材料中国科学院上海细胞库提供宫颈癌 细胞、人正常宫颈上皮细胞系 ；美国 公司提供 转染试剂；公司提供 蛋白定量试剂盒（）、二甲基亚砜（，）、（，二甲基噻唑），二苯基四氮唑溴盐（，），试剂盒；日本 公司提供荧光定量、反转录、试剂盒。北京 公司提供双荧光素酶报告基因试剂盒。上海碧云天生物科技公司提供 试剂盒、放射免疫沉淀测定（，）蛋白裂解液、碘化丙啶（，）试剂盒、膜联蛋白异硫氰酸 荧 光 素（，）。上海煊生物科技公司提供所有抗体。美国 公司提供 酶标仪。美国 公司提供 流式细胞仪。细胞培养用含 胎牛血清洛斯维 帕克纪念研究所（，）培养基培养正常人宫颈上皮细胞（，）、宫颈癌 细胞。培养条件：饱和湿度、。细胞融合达 ，对数生长细胞采用 胰蛋白酶消化传代，接种于 孔 板。、分别转染宫颈癌 细胞，并据此分组。检测收集以上各组细胞，提取总 ，浓度与纯度采用微量核酸测定。将 使用 反转录试剂盒反转录为 ，根据说明书配置反应体系。引物：（正向：；反 向：）；（正 向：；反 向：）；（正向：；反 向：）；（正 向：；反向：）。条件：预变性、，变性、，退火、，延伸、，完成 个循环后，再延伸、，琼脂糖凝胶电泳产物。采用 软件分析条带灰度值，以 为内参，计算 相对表达量；以 为内巴楚医学 年第卷第期 ，参，计算 相对表达量。流式细胞术检测将以上各组细胞用不含 的胰酶进行消化处理，并重悬。将 与 依照试剂盒说明书先后加入，避光孵育 。采用流式细胞仪（）检测波长 与 的荧光强度。实验检测以上各组细胞分别培养、，并在以上时间点加入 溶液，孵育。加入 的 ，震荡 。酶标仪检测 处吸光度值（，）。根据 值计算细胞增殖率，计算公式：细胞增殖率（）（实验组 值空白对照组 值）。检测取以上各组细胞提取总蛋白，试剂盒测定蛋白浓度，行 电泳、转膜，脱脂奶粉封闭液 室 温 封 闭。分 别 加 入 兔 抗 人 抗体、兔抗人 抗体、兔抗人 抗体、兔抗人 抗体、兔抗人 抗体、兔抗人 抗体，稀释比例分别为 ，。在孵育过夜，洗膜。按照稀释比例 加入二抗，室温孵育，洗膜次，曝光显影。采用 凝胶分析软件对各蛋白条带进行定量分析，以 为内参，计算蛋白相对表达水平。双荧光素酶检测根据 数据库的 与 区域结合位点，构建 突变型表达载体（）和 野生型表达载体（）。按照 个孔接种 孔板，细胞对数生长期时将 、转染 细胞，再分别转染 、。根据双荧光素酶试剂盒说明书进行检测、分析。统计学分析采用 统计学软件进行数据处理，计量资料以（）表示，采用独立样本检验。多组间数据比较 采 用 单 因 素 方 差 分 析，最 小 显 著 性 差 异 法（，）检验进一步多重比较。为差异有统计学意义。结果宫 颈 癌 组 织 和 细 胞 中 、表达与正常宫颈组织相比，宫颈癌组织中 、表达明显升高，差异均有统计学意义（均）。与正常 细胞相比，细胞中 与 的表达显著增加，差异均有统计学意义（均），详见表。表 、在宫颈癌组织和 细胞中的表达（）组别 正常宫颈组织（）宫颈癌组织（）细胞 细胞 注：与正常宫颈组织相比，；与 相比，对 细胞增殖和凋亡的影响 检 测 结 果 显 示，组 较 组 表达水平明显降低（），见表。检测结果显示，组转染、时 细胞增殖活性较 组均明显下降，差异均有统计学意义（均），见图 和表。流式细胞仪检测发现，组细胞凋亡率高于 组，差异有统计学意义（），见图 和表。检测显示，组 蛋白表达降低，、蛋白表达增 加（均 ），见 图。组 、蛋白表达升高，蛋白表达减少（均），见图。表 对 细胞增殖和凋亡的影响（）组别 检测 表达 法 细胞活力 细胞活力流式细胞术检测细胞凋亡率（）巴楚医学 年第卷第期 ，注：法检测细胞活力；：流式细胞术检测细胞凋亡；与 组比较，图 对 细胞增殖活力与凋亡的影响注：、的蛋白表达条带图；：以 为内参，、蛋白的相对表达柱状图；与 组比较，图 对 细胞增殖相关蛋白表达的影响注：、蛋白表达条带图；：以 为内参，、蛋白相对表达柱状图；与 组比较，图 对 细胞凋亡相关蛋白表达的影响 对 细胞增殖和凋亡的影响 检测显示，组 表达水平下降，低于 组，差异有统计学意义（），见表。法检测显示，组、的细胞活力显著低于 组（均），见图 和表。流式细胞术检测显示，组凋亡率明显高于 （），见图 和表。与 组相比，组 、蛋白明显降低，、蛋白表达显著增加，差异均有统计学意义（均），见图。表 对 细胞增殖与凋亡的影响（）组别 检测 表达 法 细胞活力 细胞活力流式细胞术检测细胞凋亡率（）巴楚医学 年第卷第期 ，注：法检测细胞活力；：流式细胞术检测细胞凋亡；与 组比较，图 对 细胞增殖活力与凋亡的影响注：、蛋白表达条带图；：以 为内参，、蛋白相对表达柱状图；与 组比较，图 对 细胞增殖及凋亡相关蛋白表达的影响 与 的作用关系双荧光素酶检测结果显示，与过表达 组对比，过表达 可抑制 转染的 细胞荧光素酶活性，但对 转染的 细胞荧光素酶活性无明显影响，见图。注：与 组相比，图 与 的靶向作用关系讨论近年来，临床宫颈癌发病率逐年升高，且呈现年轻化趋势。宫颈癌作为女性恶性肿瘤之一，对女性身心健康造成严重影响。深入研究其发生发展的分子机制，对宫颈癌分子靶向治疗药物的研发至关重要。既往研究发现，结直肠癌、非小细胞肺癌、卵巢癌等组织中 、异常表达，并参与细胞侵袭、迁移。本研究显示，宫颈癌组织和 细胞中 、表达明显升高，说明 、表达异常可能与宫颈癌细胞的增殖、凋亡存在相关性。本研究在宫颈癌组织、宫颈癌 细胞中检测 、呈高表达，与赵晨阳等报道结果基本一致。宫颈癌的发生发展并非单一过程，多种抑癌基因、癌基因表达失衡或失常，是影响癌细胞转归、无控制增殖的关键。现代研究发现，在基因组上约 定位在与肿瘤相关的脆性位点，通过对靶分子的识别、结合，在转录后水平调控 翻译或直接造成 降解，在肿瘤发生发展中发挥基因调控作用。是一种新近发现的 ，可促进肠癌细胞周期转换、细胞增殖与侵袭，同时抑制细胞凋亡。在非小细胞肺癌、乳腺癌中 异常高表达。本研究显示，转染、的 细胞活性明显受抑；增殖相关蛋白 和凋亡抑制蛋白 下调，细胞周期抑制蛋白 、及凋亡相关蛋白 、明显上调。是一种细胞周期素，可调控细巴楚医学 年第卷第期 ，胞由 期进入期，当 蛋白高表达，可使 期缩短，使其加速进入期，促进肿瘤细胞的快速增殖。是一种抗凋亡基因，其主要存在于线粒体中，主要通过抑制细胞周期的阻滞，发挥抗凋亡效应，组织中 蛋白高表达，对促进肿瘤发生至关重要。属于细胞周期蛋白依靠性激酶抑制剂家族，与细胞周期控制过程密切相关，对肿瘤抑制起到重要作用。抗体是 活化形式，在程序性细胞凋亡或死亡中发挥关键作用。是一种水溶性相关蛋白，属于兔抗人单克隆抗体，对细胞凋亡具有促进作用。既往研究发现，大部分恶性肿瘤中 均呈过表达 。同样，本研究显示，在宫颈癌 细胞及宫颈癌组织中 表达显著增加，下调宫颈癌 细胞中 表达，可抑制癌灶细胞的增殖活力，促进癌灶细胞凋亡。等 研究表明，与肿瘤远端转移、晚期临床分期正相关。薛明强等 表明，在肺癌放射抗性 细胞中，通过下调 可抑制 信号通路，拮抗细胞增殖，促进细胞凋亡。同时，本研究经双荧光素酶检测发现，过表达 可抑制 转染的 细胞荧光素酶活性，提示 可靶向调控 的表达。综上所述，宫颈癌的发生发展与 、存在密切联系，可通过靶向调控 调节宫颈癌细胞的增殖与凋亡。在临床宫颈癌的诊疗、预后评估中可将 、作为重要参考指标。此外，尽管本研究初步探讨了 、对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响，但其具体作用机制仍需要进一步探讨。参考文献：徐笑宇，张鑫宇，刘瑶，等血清中长链非编码 在宫颈癌及宫颈上皮内瘤变中的临床意义现代肿瘤医学，（）：邱梦婷，王佳，张甲倩，等细胞肌腱膜纤维肉瘤因子调节免疫细胞分化及功能机制 中华临床免疫和变态反应杂志，（）：赵晨阳，李琼 及 对宫颈癌细胞增殖，凋亡的影响及机制研究中国癌症防治杂志，（）：，（）：，（）：黄新造，占桂香，赛君，等 表达与肝细胞癌患者预后的相关性 实用癌症杂志，（）：叶火林，高淑平，刘汉起，等 肺癌相关肿瘤标记物及 在肺癌患者血清中的表达及意义检验医学与临床，（）：段秋香，陈程，彭彬峰，等 长链非编码 在肿瘤中的研究进展新医学，（）：刘凤环 靶向 对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响中国药师，（）：范晓红，张喜梅，马玲，等 靶向调控 影响卵巢癌细胞增殖和凋亡的相关机制研究中国妇产科临床杂志，（）：，（）：李醒，黄俊星 作为 的 在恶性肿瘤中的作用国际肿瘤学杂志，（）：何旭，姚健，王程远，等肺癌中 与 表达的相关性及其对远期生存的预测价值 临床和实验医学杂志，（）：，（）：薛明强，刘明博，许广辉，等 通过调控 表达增加肺癌细胞放射敏感性中华放射肿瘤学杂志，（）：收稿日期 巴楚医学 年第卷第期 ，