lncRNA_HOTAIR...激素性股骨头坏死的机制研究_张峥.pdf

基金项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金项目资助(2020D01C223)作者单位:830000乌鲁木齐,新疆医科大学第五附属医院骨科中心(张峥、崔泳、丁路、王武、黄涛);830054乌鲁木齐,新疆医科大学第一附属医院骨肿瘤外科(王翀)通信作者:崔泳,电子信箱:14753634 lncRNA HOTAIR/miR-17-5p/Smad7 通路调控激素性股骨头坏死的机制研究张峥崔泳王翀丁路王武黄涛摘要目的研究 lncRNA HOTAIR 对激素性股骨头坏死(steroidinduced necrosis of femoral head,SONFH)的影响。方法收集激素性股骨头坏死患者骨髓组织 25 例,正常对照组为 25 例股骨颈骨折患者。培养人骨髓间充质干细胞(hBMSCs),用地塞米松(DEX)培养,CCK-8 测定细胞增殖。用 HOTAIR 过表达载体或 miR-17-5p 模拟物转染细胞。hBMSCs 分为 hBMSCs 组、hBMSCs+成骨诱导组、hBMSCs+成骨诱导+空载组、hBMSCs+成骨诱导+过表达 HOTAIR 组、hBMSCs+成脂诱导组、hBMSCs+成脂诱导+空载组和 hBMSCs+成脂诱导+过表达 HOTAIR 组。RT-qPCR 测 HOTAIR、miR-17-5p、Smad7、RUNX2、RRAR-的 mRNA 表达。Western blot 法检测 Smad7 蛋白的表达。双荧光素酶报告基因测法确认 HOTAIR 和 miR-17-5p 间的结合。碱性磷酸酶(ALP)活力检测试剂盒与茜素红染色评估细胞的成骨分化;油红 O 染色评估细胞的成脂分化。结果HOTAIR 和Smad7 在激素性股骨头坏死组织中表达上调,而 miR-17-5p 表达下调(P 均 0.05)。双荧光素酶报告实验证实 hBMSCs 中HOTAIR 的直接结合靶点是 miR-17-5p,而 Smad7 是 miR-17-5p 的靶基因。HOTAIR 的过表达诱导了 hBMSCs 的成脂分化和 RRAR-表达,并抑制了成骨分化和 RUNX2 表达(P 均 0.05)。结论过表达 lncRNA HOTAIR 直接靶向 miR-17-5p 并抑制 hBMSCs 的成骨分化,还能够促进成脂分化和 Smad7 的表达。关键词类固醇股骨头坏死miR-17-5p成骨分化成脂分化中图分类号R681.8;R274.9文献标识码ADOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2023.02.012Mechanism of LncRNA HOTAIR/miR-17-5p/Smad7 Pathway Regulating Steroid-induced Femoral Head Necrosis.ZHANG Zheng,CUI Yong,WANG Chong,et al.Orthopedics Center,Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Xinjiang 830000,ChinaAbstractObjectiveTo investigate the effect of LncRNA HOTAIR on steroid-induced necrosis femoral head(SONFH).Meth-odsBone marrow tissues of 25 patients with SONFH were collected,and 25 patients with femoral neck fractures were included in thecontrol group.Human bone marrow mesenchymal stem cells(hBMSCs)were cultured with Dexamethasone(DEX),and cell proliferationwere measured by CCK-8.Cells were transfected with HOTAIR overexpression vector or miR-17-5p mimics.HBMSCs were dividedinto 7groups,including hBMSCs group.HBMSCs+osteogenic induction solution group;HBMSCs+osteogenic induction solution+non-load group;HBMSCs+osteogenic induction solution+overexpression HOTAIR lentivirus group;hBMSCs+adipogenic inductionsolution group;hBMSCs+adipogenic induction solution+non-load group;hBMSCs+adipogenic induction solution+overexpressionHOTAIR lentivirus group.The mRNA expressions of HOTAIR,miR-17-5p,Smad7,RUNX2 and RRAR-were detected by real-time quantitative polymerase chain reaction(RT-qPCR).The expression of Smad7 protein was detected by Western blot.Dual-lucifer-ase reporter gene assay were performed to confirm the binding between HOTAIR and miR-17-5p.The osteogenic differentiation of cellswas evaluated by alkaline phosphatase(ALP)activity assay kit and alizarin red staining.Adipogenic differentiation was evaluated by oilred O staining.ResultsThe expressions of HOTAIR and Smad7 were up-regulated in SONFH tissues,while the expression of miR-17-5p were down-regulated(all P 0.05).Dual-luciferase reporter gene assay confirmed that the direct binding target of HOTAIR inhBMSCs was miR-17-5p,and Smad7 was the target gene of miR-17-5p.Overexpression of HOTAIR induced adipogenic differentia-tion and RRAR-expression of hBMSCs,and inhibited osteogenic differentiation and RUNX2 expression(all P 0.05).ConclusionOverexpression of HOTAIR directly targets miR-17-5p and inhibits osteogenic differentiation of hBMSCs,and also promotes adipogenicdifferentiation and expression of Smad7.Key wordsSteroid-induced femoral head necrosis;MiR-17-5p;Osteogenic differentiation;Adipogenic differentiation75医学研究杂志 2023 年 2 月第 52 卷第 2 期论著糖皮质激素(glucocorticoids,GC)被广泛用于治疗自身免疫性疾病,但治疗后 2 年内易出现骨坏死症状1,2。糖皮质激素性股骨头坏死(steroid inducednecrosis of femoral head,SONFH)已涉及年轻人,严重影响患者的生活质量2。然而,激素性股骨头坏死的发病机制尚不清楚。研究显示,人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchyml stem cells,hBM-SCs)与骨坏死的发生、发展密切相关3。因此,研究hBMSCs 的异常成骨分化机制在激素性股骨头坏死的治疗中有重要意义。长链非编 码 RNA(long non-coding RNA,ln-cRNA)HOTAIR 是一种关键的致癌 lncRNA,参与细胞增殖、凋亡与分化的调节4。已知 lncRNA 和微小RNA(miRNA)的相互作用可以影响 hBMSCs 的成骨分化,且上调 miR-17-5p 抑制成骨5,6。但在激素性股骨头坏死中 HOTAIR 对 miR-17-5p 的调控关系鲜有报道。因此,本研究探讨激素性股骨头坏死中HOTAIR 的异常表达对 hBMSCs 的成脂和成骨分化的影响以及对预测靶基因的调控作用。材料与方法1.受试者和标本采集:骨髓样本取自 2018 年 4月 2020 年 3 月在笔者医院接受手术的 25 例激素性股骨头坏死患者和 25 例股骨颈骨折患者。根据Steinberg 或宾夕法尼亚大学的系统,术前 X 线片和磁共 振 诊 断 激 素 性 股 骨 头 坏 死。所 有 服 用 超 过1800mg 糖皮质激素或长期糖皮质激素治疗超过 4 周的激素性股骨头坏死患者均纳入研究,同时排除心血管疾病、先天性疾病或肿瘤相关疾病的患者。将 25例激素性股骨头坏死患者骨髓组织命名为激素性股骨头坏死组;将 25 例股骨颈骨折患者的骨髓组织命名为正常对照组,股骨颈骨折患者没有糖皮质激素治疗史。将 25 例激素性股骨头坏死的患者命名为激素性股骨头坏死组。所有参与者均签署了书面知情同意书,本研究获得了笔者医院医学伦理学委员会批准(伦理审批号:20180182-91)。2.实验试剂耗材:hBMSCs 购自武汉普诺赛生命科技公司;地塞米松(dexamethasone,DEX,ID0170)和茜素红染液试剂盒(G8550)购自美国 Solarbio 科技有限公 司;-甘 油 磷 酸 钠(G8100)和 抗 坏 血 酸(A8100)购自美国 Sigma-Aldrich 生物科技有限公司;3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、吲哚美辛及油红 O 染色液(G1262)购自北京索莱宝科技有限公司;丽春红 S(3761-53-3)购自上海国药集团化学试剂 有 限 公 司;电 化 学(electrochemiluminescence,ECL)发光液(ECL-0011)购自北京鼎国生物技术有限责任公司;碱性磷酸酶测试盒购自南京建成生物工程研究所有限公司 A059-2;Trizol 购自美国英杰生命技术有限公司;SYBRGreen PCR 试剂盒购自德国Qiagen 公司;real-time 检测仪(ABI-7500)购自美国应用生物系统公司。3.hBMSCs 培养:hBMSCs 在含 10%胎牛血清的低糖 DMEM 培养基中培养,培养环境为 37,含 5%CO2,每 3 天更换新鲜培养基。将 hBMSCs 细胞分为两组,分别命名为对照组和地塞米松组。收集 5 105个/毫升正常培养的细胞用于对照组,而地塞米松组 hBMSCs 则在上述培养基中加入 1 10-7mol/L的地塞米松 30l,其余方法不变,收集 5 105个/毫升细胞用于检测。4.细胞转染:过表达 HOT