miRNA-222调控CD...癌细胞增殖和迁移的机制研究_殷嘉.pdf

常熟理工学院学报（自然科学）Journal of Changshu Institute of Technology（Natural Sciences）第 37 卷第 2 期2023 年 3 月Vol.37 No.2Mar.,2023miRNA-222 调控CDKN1b和CDKN1c表达促进乳腺癌细胞增殖和迁移的机制研究 殷 嘉1,2*，何树燕3*，陈 洁1，潘 洁1，邵 芳1（1.南京医科大学附属常州市第二人民医院 中心实验室，江苏 常州 213003；2.常州武进区疾病预防控制中心，江苏 常州 213003；3.南通大学附属江阴医院 肿瘤科，江苏 江阴 214400）摘要：通过检测乳腺癌样本和正常组织样本中 miR-222表达量，转染miR-222模拟物（mimics）和抑制物（inhibitors），用CCK-8和Transwell检测miR-222对乳腺癌细胞增殖能力和迁移能力的影响 进一步预测 miRNA-222 的靶基因，构建其过表达载体和预测靶基因的荧光素酶报告载体 通过双荧光素酶检测系统鉴定靶基因，点突变实验验证与靶基因的结合位点 RT-PCR 检测 miRNA-222 过表达或抑制后对靶基因表达的影响 分析 CDKN1b 和 CDKN1c 高、低表达水平与乳腺癌患者生存率的关系 结果表明与正常乳腺组织比较，肿瘤组织中 miR-222 表达显著上升（P0.000 1），miR-222 的表达与淋巴结转移呈正相关 miR-222 过表达后能促进乳腺癌细胞的增殖和迁移，反之则会抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移 双荧光素酶报告系统显示 miRNA-222 过表达能显著抑制 CDKN1b 和 CDKN1c的荧光素酶活性，点突变实验证实 miR-222 通过“种子区”与 CDKN1b、CDKN1c 的靶位点结合，从而负向调控 CDKN1b 和 CDKN1c 的表达过表达 miRNA-222 后 CDKN1b 和 CDKN1c mRNA 的表达量显著降低（P0.01）相反，抑制 miRNA-222 表达后 CDKN1b 和 CDKN1c mRNA 的表达量上升（P0.05）CDKN1b 和 CDKN1c 高表达患者的总体生存率显著高于低表达患者（P0.05）本研究表明 miRNA-222 通过负向调控 CDKN1b 和 CDKN1c 基因表达，进而影响乳腺癌细胞的增殖和迁移 关键词：miR-222；乳腺癌细胞；CDKN1b；CDKN1c；增殖；迁移中图分类号：R393 文献标志码：A 文章编号：1008-2794（2023）02-0078-08收稿日期：2022-10-15基金项目：常州市科技应用基础研究计划项目“莱菔硫烷通过 pERK 介导的 Nrf2/HO-1 信号轴抑制结肠癌细胞效应的机 制研究”（CJ20200098）；常州市青苗人才培养项目（CZQM2020070）；江阴市卫健委面上项目“阻断 CD47/SIRP 调控 IFN-信号通路诱导肺癌肿瘤血管正常化的机制研究”（S202101）*共同第一作者通信作者：邵芳，助理研究员，硕士，研究方向：肿瘤免疫，E-mail：近年来，乳腺癌已成为女性发生概率最高的癌症，在全球范围内对公共健康构成了巨大威胁 1 miR-222 定位于 Xp11.3 上，与 miR-221 高度同源 2 在很多恶性肿瘤中，miR-222 都有异常表达发生 Petrovic等发现 miR-222 的表达水平在原位癌中明显高于未转化组织，miR-222 通过靶向 Caspase-3 抑制细胞凋亡和肿瘤形成，在癌细胞增殖中起促进作用 3 DOI:10.16101/32-1749/z.2023.02.012第 2 期79本研究通过检测常州市第二人民医院收集的乳腺癌石蜡样本中 miR-222 的表达量，并分析与临床病理特征的联系；筛选靶基因后通过双荧光素酶报告基因法来鉴定 miR-222 与靶基因的作用关系；再利用乳腺癌细胞系，通过转染miR-222的模拟物（mimics）和抑制剂（inhibitors），分析探讨miR-222对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响以及在乳腺癌肿瘤发展中的作用1 方法1.1 材料收集常州市第二人民医院肿瘤科乳腺癌石蜡样本 128 例，剔除不含肿瘤组织或者肿瘤组织量太少的石蜡样本32例，其余96例石蜡样本和11例正常样本用于定量检测miRNA表达量实验 MCF-7、MDA-MB-231细胞由中国科学院上海生科院细胞资源中心提供1.2 QIAGEN miRNeasy FFPE kit 提取肿瘤组织总 RNA首先对石蜡组织切片进行脱蜡处理，加入 1 mL 二甲苯，充分振荡 10 s，室温离心 2 min，吸取并遗弃上部已溶解石蜡的二甲苯溶液；加入 1 mL 无水乙醇，充分振荡，室温下离心 2 min 弃无水乙醇，静置至所有残余酒精全部挥发 加入 150 L 裂解缓冲液和 10 L 蛋白酶 K，混匀后 55 孵育 15 min，再 80 孵育 15 min；加入 320 L 结合缓冲液，轻轻混匀后转移到 gDNA Eliminator 离心柱上，12 000 r/min 离心 30 s，弃离心柱，向离心后的液体中加入 1 120 L 无水乙醇，转移液体到新的 RNeasyMinElute 离心柱，12 000 r/min 离心 30 s 后加入 500 L 洗涤液，离心后重复洗涤步骤，最后加 1530 L ddH2O 洗脱 RNA，-80 保存备用1.3 miR-222 靶基因预测和引物合成采用靶基因预测软件对 miR-222 的靶基因进行预测，并根据预测靶基因核苷酸序列，设计出正向引物和反向引物以及点突变正反向引物，引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物信息详见表 11.4 miR-222 反转录和荧光定量 PCR检测利用 stem-loop qRT-PCR 方法检测miR-222 的表达根据反转录试剂盒TaqManMicroRNAReverse Transcription Kit(Applied Biosystems)操 作 步 骤，将 10 ng 总 RNA 反转录合成 cDNA以 cDNA 为模板进行 PCR 反应 miR-222 表达分析的内参基因为 RUN44靶基因反转录按照 PrimeScript RT reagent Kit（Takara）说明书进行1.5 载体构建根据miR-222前体序列设计引物，以基因组 DNA 为模板，PCR 扩增获得约 459 bp表 1 PCR 引物的信息引物名称引物序列（5-3）目的产物长度/bp用途miR-222F:cccaagcttTTGTTTGCTGCTGGATCTCC/R:ccgctcgagAGTGTGTGTGTGAGTGTGTG459克隆CDKN1bF:cgagctcCATATCGCTGACTTCATGGA/R:cccaagcttCCCTTCCCCAAAATTGCTTC325克隆CDKN1bm1F:CCTTTGTGCGTCAAGAATGTGCCTTC/R:GAAGGCACATTCTTGACGCACAAAGG325克隆CDKN1bm2F:ATCTACGACATAAACTTTGGGG/R:CCCCAAAGTTTATGTCGTAGAT325克隆CDKN1cF:cgagctcAAAGCCCAAAGACCCCGA/R:cccaagcttCAAAACCGAACGCTGCTCTG125克隆CDKN1cmF:ACCGTTCATCTACGAGCAAC/R:GTTGCTCGTAGATGAACGGT125克隆CDKN1bqF:AATAAGGAAGCGACCTGCAACC/R:TGCTCCACAGAACCGGCATT110定量PCRCDKN1cqF:ACCAGCTGCACTCGGGGATTT/R:TTTAATGCCACGGGAGGAGGCGGGAA216定量PCRGAPDHqF:GACTCATGACCACAGTCCATGC/R:AGAGGCAGGGATGATGTTCTG113定量PCR片段，通过酶切连接反应将其连入真核表达载体 pcDNA3.1，构建 miR-222 过表达载体 pcDNA3.1/miR-222根据预测的靶基因 CDKN1b 和 CDKN1c 的 3-UTR 与 miR-222 结合的靶位点设计引物，PCR 分别扩增获得约 325 bp、125 bp 的 DNA 片段，将其连入靶基因报告载体 pMIR-REPORT，构建靶基因报告载体 pMIR-殷嘉，等：miRNA-222 调控CDKN1b和CDKN1c表达促进乳腺癌细胞增殖和迁移的机制研究常熟理工学院学报（自然科学）2023 年80CDKN1b 和 pMIR-CDKN1c根据种子区设计突变引物，与 CDKN1b 和 CDKN1c 基因 3-UTR 引物进行重叠 PCR，对靶位点进行突变，最后将突变产物连入 pMIR-REPORT，构建候选靶基因靶位点突变报告载体pMIR-CDKN1bmut 和 pMIR-CDKN1cmut1.6 细胞培养及转染MCF-7、MDA-MB-231 细胞在 37、5%CO2的培养箱中培养并传代 转染前 24 h，将对数生长至 80%左右的细胞消化计数后，以1.5105/mL均匀铺于6孔板中，按转染试剂Lipo2000（Invitrogen）操作说明进行转染，转染 48 h 后回收细胞，采用 Trizol（Invitrogen）提取 RNA 后检测 miR-222、CDKN1b、CDKN1c 的表达量1.7 CCK8 增殖和迁移试验细胞增殖：CCK8（Cell Counting Kit-8 细胞计数试剂）检测 miR-222 对乳腺癌细胞 MCF-7、MDA-MB-231增殖能力的影响 将对数期生长的MCF-7、MDA-MB-231细胞制成单细胞悬液，以每孔2104/mL细胞接种到 96 孔板中，培养 24 h 后进行分组转染 miR-222 mimics 和 miR-222 inhibitor 及相应的对照，分别在转染后24，48，72 和 96 h 时终止培养，加入 10 LCCK8 试剂继续孵育 3 h，最后在酶标仪上测 450 nm 波长处的吸光值细胞迁移：采用孔径 0.8 mol/L transwell 小室及 24 孔板铺板，转染后 24 h 的 1.5105MCF-7、MDA-MB-231细胞铺小室内，铺板 24 h 后用 PBS 清洗小室 1 遍，然后用甲醇固定 20 min 后再用结晶紫染色 20 min 去除上室细胞，倒置显微镜拍照，每孔随机选取 3 个视野细胞计数 实验重复 3 次1.8 双荧光素酶检测转染前24 h，消化MDA-MB-231细胞并计数，以7.5104/孔均匀铺于24孔板中，同样用X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent（Roche）进 行 转 染，转 染 48 h 后 使 用 Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega）进行双荧光素酶检测：弃培养基，用 PBS 洗涤细胞一次，加 100 L/孔细胞裂解缓冲液 PLB，振荡15 min；取 10 L 细胞裂解液加入 50 LLAR II，用检测仪检测萤火虫荧光素酶活性；再加入 50 LStop&Glo试剂，检测海肾荧光素酶活性1.9 统计分析采用GraphPad Prism 8统计软件处理实验数据 双荧光素酶检测结果采用萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性进行分析 实验结果表示为MeanSE，组间比较采用Student-t检验或ANOVA方差分析，P2，P0.000 1)此外，临床病理分析显示 miR-222 的强度与乳腺癌患者淋巴结转移相关（P=0.000 2），见图 1（a）miR-222 在乳腺癌组织与癌旁组织中的相对表达量；（b）miR-222 在不同病理阶段 N0（无区域淋巴结转移），N1（区域淋巴结转移）的表达情况图 1 miR-222 在乳腺癌组织与正常对