2016-2020年安徽省...特征及CVA6基因进化分析_傅荔艳.pdf

病 毒 学 报CHINESE JOURNAL OF VIROLOGYVol.39No.2March 2023第 39 卷 第 2 期 2 0 2 3 年 3 月20162020年安徽省手足口病流行病学特征及CVA6基因进化分析傅荔艳1，葛盈露2，马婉婉2，冯明子1，王鹏2，罗婉蓉2，孙永2，史永林1，2*（1.安徽医科大学 公共卫生学院，合肥 230032；2.安徽省疾病预防控制中心 安徽省公共卫生研究院 安徽省医疗卫生重点专科病原微生物分子生物学实验室，合肥 230601）摘要：为了解安徽省 20162020年手足口病（Hand，foot and mouth disease，HFMD）流行特征与病原谱构成，及分析CVA6（Coxsackievirus A6，CVA6）VP1区基因进化情况。本研究收集 20162020年安徽省 HFMD 病例流行病学资料，描述性流行病学方法分析病例三间分布情况。随机选取 480份 HFMD其他肠道病毒阳性咽拭子样本，RTPCR扩增肠道病毒 VP1基因片段，测定基因序列并鉴定其他肠道病毒基因型别。生物软件分析部分代表性 CVA6基因序列相似性并构建系统发育树。流行病学结果显示，20162020年安徽省 HFMD 发病率仍处于较高水平，但重症病例与死亡病例数有所减少，5个年度均以其他肠道病毒流行为主，五岁以下散居儿童为主要患病人群，男女性别比为 1.50 1。20162019 年度发病均呈现为双峰流行模式。病原分型鉴定结果为 CVA6 215 例（215/245，87.76%），CVA10 16 例（16/245，6.53%），CVA4 12 例（12/245，4.90%），CVA5 1 例（1/245，0.41%），CVA2 1 例（1/245，0.41%）。选取的 60 株代表性 CVA6 VP1 区序列相似性分析表明，各序列间 VP1 核苷酸序列相似性为 91.6%100%，氨基酸序列相似性为 97.4%100%；与 D3基因型代表株之间核苷酸序列相似性为 90.7%98.9%，氨基酸序列相似性为 96.7%100%；与 CVA6原型株核苷酸序列相似性为 82.3%83.9%，氨基酸序列相似性为 95.1%96.7%。进化分析显示，CVA6划分为 AD 四个基因型，60株 CVA6毒株均属于 D3基因亚型中的 D3a分支，为中国大陆地区优势流行型别。应加强对安徽省 CVA6 及其他肠道病毒监测，这对制定减轻 HFMD 疾病负担以及防控HFMD策略具有重要意义。关键词：手足口病；柯萨奇病毒 A组 6型；基因进化；流行特征中图分类号：R373.2 文献标识码：A 文章编号：10008721（2023）02044508DOI：10.13242/ki.bingduxuebao.004239手 足 口 病（Hand，foot and mouth disease，HFMD）是由多种肠道病毒（Enterovirus，EV）引起的主要感染 5 岁以下儿童的急性传染病1。一般情况下，该病呈自限性，常见症状为发热、手足疱疹或口腔水泡；少数患者感染后会出现脑炎、急性弛缓性麻痹、神经源性肺水肿和心肌炎等并发症，严重时可致死亡2。肠道病毒为小核糖核酸病毒科肠病毒属，是一种小型无包膜的单链 RNA 病毒3。根据VP1 区核苷酸差异可将肠道病毒划分为 AD 型，90%以上 HFMD为 A组肠道病毒引起，其中肠道病毒 A 组 71 型（Enterovirus A71，EVA71）和柯萨奇病毒 A 组 16 型（Coxsackievirus A16，CVA16）为引发 HFMD 的两种主要病原4，EVA71 常与重症HFMD相关。由于肠道病毒的 RNA聚合酶缺乏校对功能，在进化过程中常常会发生重组并产生新基因型5，导致原有的流行模式改变，呈现出多病原共流行现象。在非 EVA71非 CVA16 其他肠道病毒中，柯萨奇病毒 A 组 6 型（Coxsackievirus A6，CVA6）引起的HFMD 病 例 呈 现 增 长 趋 势4。研 究 表 明，感 染CVA6 后引起的疾病表现与其他肠道病毒略有不同。与 EVA71和 CVA16相比，感染 CVA6更容易出现一系列非典型皮肤表现（更广泛的疱疹和溃疡）68及脱甲症9，称之为“非典型 HFMD”。此外，CVA6 也 常 导 致 疱 疹 性 咽 峡 炎（Herpetic angina，HA）发生，主要表现为口腔水泡并伴随疼痛感。但由 于 该 疾 病 不 在 国 家 疾 病 监 测 范 围 内，因 此 由CVA6感染引起的疾病负担可能被低估4。研究表明，CVA6 已逐渐成为中国多个省份引起 HFMD 的主要病原10，11。2008 年阜阳 HFMD 疫收稿日期：20220523；接受日期：20220922基金项目：安徽省自然科学基金项目（项目号：1708085QH186），题目：TLR 基因多态性与 EVA71 导致的手足口病重症的关联性研究作者简介：傅荔艳（1998），女，主要从事肠道病毒监测与分子进化研究，Email：通讯作者：史永林（1978），男，副主任技师，主要从事传染病病原监测与分子进化研究，Email：开放科学（OSID）病 毒 学 报39卷情大规模暴发以来，安徽省 HFMD 发病率持续高于全国平均水平，造成了严重的疾病负担和社会影响12。本研究通过分析安徽省 20162020年 HFMD流行特征和病原谱构成情况及 CVA6 基因进化特征，为今后评估 HFMD 疾病负担、开展肠道病毒基因进化研究、疫苗研发等提供数据参考。材料与方法1 资料来源安徽省 HFMD 病例数据来源于“中国疾病预防信息系统”传染病监测信息报告系统，筛选并下载2016 年 1 月 1 日2020 年 12 月 31 日流行病学资料，HFMD 病例定义符合 手足口病诊疗指南（2018 年版）。病原监测数据主要包括患者情况（姓名、性别、年龄）、发病时间、报告地点及实验室病原学检测情况等信息。2 标本来源随机选取 20162020 年 1 至 12 月安徽省各市疾控中心送来的 480 份（每年度各取 96 份）HFMD 其他肠道病毒核酸阳性轻症咽拭子标本，标本均按 手足口病预防控制指南（2009 版）要求，由专业人员采集、检测，冷链条件下运输至安徽省疾控中心实验室保存于70条件。3 病毒核酸提取及鉴定采用全自动核酸提取仪（SLA32，中国台湾圆点公司）及配套核酸提取试剂盒（635A46），按说明书要求提取核酸。将提取的核酸进行 Realtime PCR 鉴定，试剂采用西安天隆公司生产的 CVA6/CVA10双通道试剂盒，按说明书操作。以 CVA6阳性 标 本 RNA 为 模 板，使 用 Prime Script One Step RTPCR Kit Ver.2（TaKaPa，RR055A）一步法 RTPCR 试剂盒扩增其 VP1 区。引物参考文献3，13：CVA6：5CTTCGTAGTGCCACCAGATA3，5GTGGCGAGATGTCGGTTTA 3；EVA（486/488）：5TGGTAICARACIAAITWYGTIGTNCC3，5GTIGGRTAICCITCITARAACCAYTG3。目 的 片 段 大 小 分 别 为 CVA6（1109bp）、EV A 组（766bp）。扩增体系 25L，反应条件：45 30min；94 5min；94 30s，50 30s，72 70s，共 35 个循环；72 7min；4 hold。扩增后产物经 2%琼脂糖凝胶电泳分析（100V/30min），出现目的条带 PCR产物送天一辉远（武汉）公司纯化并完成双向测序。4 流行病学及生物信息分析Excel 2010 整理分析 20162020 年流行病学资料，描述性流行病学方法分析病例三间分布情况。测序结果拼接后至 NCBI 进行 BLAST 比对确定其型别。采用 DNAstar7.1中的 MegAlign 软件计算序列核苷酸和氨基酸相似性。运用 MEGA6.0软件构建本研究 CVA6 VP1 基因序列与 GenBank 下载的CVA6代表株及原型株（AY421764，Gdula）进化树，采用邻接法（NeighborJoining，NJ），Bootstrap 值设定为 1 000；完成基础进化树构建后，输出“nwk”格式上传至 iTOL 网站（https：/itol.embl.de/）在“My trees”中对进化树文件进行美化。结 果1 安徽省 20162020年 HFMD流行情况20162020年安徽省 HFMD 发病率仍处于较高水平，其中 2020 年因疫情影响发病率有所下降。20162020 年安徽省累计报告 HFMD 病例 471 995例，分别为 142 166 例、82 828 例、119 363 例、73 598例 及 54 051 例，年 发 病 率 分 别 为 231.41/10 万、133.68/10 万、190.87/10 万、115.98/10 万、85.08/10万。重症病例五个年度均有报道，分别为 588 例、220 例、118 例、17 例、6 例。20162018 年有 HFMD死亡病例报告，分别为 6例、4例、1例。2 20162020年安徽省肠道病毒病原谱监测概况20162020年安徽省通过 传染病报告信息管理系统 报告 HFMD 实验室确诊病例共计 16 650 例，分别为 1 057 例、2 955 例、4 202 例、3 962 例、4 474例。病原构成比为 EVA71阳性 1 296例，占确诊病例 7.78%；CVA16 阳 性 3 809 例，占 确 诊 病 例22.88%；其他肠道病毒阳性 11 545 例，占确诊病例69.33%。20162020年度均以其他肠道病毒报告最多，分别为 448 例（42.38%）、1 758 例（59.50%）、2 974 例（70.78%）、2 206 例（55.68%）和 4 159 例（92.95%）（图 1）。3 安徽省手足口病分布20162020 年安徽省 16 个地市均有 HFMD 病例报告，累计报告病例数位于前三位的分别为阜阳市（82 695 例）、合肥市（81 763 例）、亳州市（45 835例）。病例主要集中于 05 岁年龄组，共计 440 355例，占总病例数的 93.30%。总患病人数中，男性283 239 例，女性 188 756 例，男女性别比为 1.50：1；与总体 HFMD 人群分布情况一致。发病人群以散 4462期傅荔艳，等.20162020年安徽省手足口病流行病学特征及 CVA6基因进化分析居儿童为主，占所有病例的 76.48%。20162020 年安徽省各月份均有 HFMD 报告，发病时间存在季节性分布特征：每年 4 月起发病数明显增加，58 月为HFMD 发病主高峰期；912月为次高峰期，呈现“双峰”流行趋势。2020 年由于受新冠疫情影响，发病数锐减，只出现 1个高峰期（图 2）。4 肠道病毒基因型别鉴定480 份样本经 RTPCR 成功扩增出阳性产物264 份，成 功 测 序 245 份。序 列 分 型 鉴 定 结 果 为CVA6 215 例，占 87.76%（215/245），CVA10 16 例，占 6.53%（16/245），CVA4 12 例，占 4.90%（12/245），CVA5 1例，占 0.41%（1/245），CVA2 1例，占0.41%（1/245）。5 CVA6 VP1区遗传进化分析将成功拼接的 CVA6 VP1 基因序列与原型株（AY421764，Gdula）相比未发现碱基缺失与插入，均为 894bp。CVA6 代表株 VP1 区进化图谱显示，A基因型由原型株（AY421764，Gdula）独自构成，与本图 220162020年安徽省 HFMD月分布Figure 2Monthly distribution of HFMD in Anhui Provi