4种中草药提取液的工艺优化及抗菌效果对比研究_朱君.pdf

常熟理工学院学报（自然科学）Journal of Changshu Institute of Technology（Natural Sciences）第 37 卷第 2 期2023 年 3 月Vol.37 No.2Mar.,20234 种中草药提取液的工艺优化及抗菌效果对比研究 朱 君，张鑫悦，崔 敏，汪佳佳，周 吟，张金龙，潘红英，姜 波，张 晶（常熟理工学院 生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500）摘要：研究了黄连、杜仲、五倍子、白头翁 4 种中草药提取的最佳工艺 以乙醇为溶剂，通过超声波提取和牛津杯法，以单因素试验考察提取时间、提取温度、乙醇浓度、料液质量浓度及提取溶剂 pH等条件，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、黑曲霉的抑菌效果；并以二倍稀释法确定其最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）结果表明：在本实验条件下，4 种中草药的最佳提取条件为：提取时间 10 min，提取温度 50，乙醇浓度 60%70%，料液质量浓度 125 g/L，提取时pH 为 2.0 4 种中草药对 5 种微生物的 MIC 值在 7.8125 mg/mL，MBC 值在 31.25250 mg/mL 本研究得出的 4 种中草药的最佳提取工艺，为中草药饲料添加剂的科学配伍、配方研发以及标准化流程的建立奠定了理论基础 关键词：中草药；超声波提取；牛津杯法；最小抑菌浓度；最小杀菌浓度中图分类号：R28 文献标志码：A 文章编号：1008-2794（2023）02-0065-07收稿日期：2022-06-12基金项目：苏州市科技计划项目“苏州村域低碳型生态循环种养模式集成创新与示范”（SNG202100）；常熟理工学院大学 生创新创业项目“中草药柚子皮生产猪饲料添加剂的替抗效果研究”（XJDC2021129）通信作者：张晶，副研究员，博士，研究方向：微生物学，E-mail：畜禽养殖业中，为减少畜禽患病往往会在饲料中添加抗生素，进而造成禽畜产品中的药物残留 为促进绿色畜牧业的发展，中草药饲料添加剂在提高畜牧生产性能、免疫抗病等方面得到不同程度的应用 1 中草药具有毒副作用小、安全性高、无耐药性的特点，且原料在我国分布广泛、种类繁多、经济实惠，有利于促进饲料业的发展 2 因此，中草药饲料添加剂越来越受到广大养殖户和研究者的关注超声波提取中草药有效成分受到多种因素的影响，包括提取时间、提取温度、所用的有机溶剂浓度、料液质量浓度和提取溶剂 pH 等 以往研究多从中草药提取液有效成分对特定微生物的抑菌效果 3 来优化中草药有效成分的提取条件 中草药产地众多，结构和成分复杂，提取条件的变化可能会引起药性的变化 同时，在特定中草药饲料添加剂配方中，可能同时存在多个中草药品种，若不同中草药各自应用其最优提取条件，将大大降低生产效率，提高生产成本本试验选用黄连、杜仲、五倍子、白头翁 4 种中草药，研究其对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、黑曲霉在体外的抑菌效果，筛选出多种中草药共存条件下的最优提取条件，为研发特定功能的中草药饲料添加剂提供基础实验数据DOI:10.16101/32-1749/z.2023.02.011常熟理工学院学报（自然科学）2023 年661 材料与方法1.1 实验材料菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、黑曲霉（常熟理工学院微生物实验室保存）中草药：黄连、杜仲、五倍子、白头翁均购自亳州市康美中药城培养基及试剂：牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、无水乙醇、PBS 缓冲液、无菌水1.2 实验仪器数控超声波清洗器（KQ5200DE），昆山市超声仪器有限公司；单人单面净化工作台（SW-CJ-1FD），上海苏净实业有限公司；恒温水浴锅（B-260），上海亚荣生化仪器厂；旋转蒸发器（RE5203），上海亚荣生化仪器厂；循环水式真空泵（SHB-IIIA），临海市永昊真空设备有限公司；台式冷冻恒温振荡器（THZ-C-1），太仓市实验设备厂；光吸收全波长酶标仪（readmax1900），上海闪谱生物科技有限公司；振荡培养箱（MQD-B3NR），上海旻泉仪器有限公司；立式高压蒸汽灭菌器（LDZX-75L），上海申安；全自动高压蒸汽灭菌器（PHM-70L），上海尧勋智能科技有限公司；二氧化碳培养箱（YCP 系列），上海易亮医疗器械有限公司1.3 实验方法1.3.1 菌种活化与菌悬液制备将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌及酵母菌制成菌悬液，校正菌液至 108 CFU/mL 备用 将黑曲霉制成孢子悬液，校正悬液浓度至 108个/mL 备用 4 1.3.2 中草药提取的单因素试验准确称取中草药样品 5.0 g，4 种中草药因质地不同，粉碎后颗粒大小有异，故根据相关资料，黄连、白头翁粉碎后过 40 目筛 5-6，杜仲、五倍子过 80 目筛 7-8，备用 选取以下提取条件进行优化，每种处理做 3 个重复（1）提取时间分别设为 10，20，30，40 min 提取温度为 40，乙醇浓度为 80%（2）提取温度分别设为 40，50，60，70，提取时间为 10 min，乙醇浓度为 80%（3）乙醇浓度分别设为 60%，70%，80%，90%，提取时间为 10 min，提取温度为 40（4）料液质量浓度分别设为 166.67，125，100，83.33 g/L，提取时间为 10 min，提取温度为 40，乙醇浓度为 80%（5）提取溶剂的 pH 分别设为 2.0，3.0，4.0，5.0 9（多项研究表明偏酸度可提高中草药的抑菌效果 10-13），提取时间为 10 min，提取温度为 40,乙醇浓度为 80%1.3.3 中草药提取物对微生物生长的抑制作用用牛津杯双层平板法测定抑菌圈直径 14，接药量为50 L/杯 细菌实验平板培养24 h，真菌平板培养48 h1.3.4 药物最小抑菌浓度 MIC 测定对菌液、中草药提取液及两者的混合物分别依次进行稀释，即二倍稀释法 采用 96 孔板测定，每孔滴加100 L 供试液体混合物 分别设空白、阴性对照和阳性对照 细菌恒温培养 1620 h，真菌恒温培养 3240 h后，通过酶标仪检测透光率观察结果 若试验孔的透光率均 95%视为有菌生长，或 OD600值低于阳性对照孔 5%判定为无菌生长 因此，无菌生长的最低浓度孔，即为中草药提取物的 MIC 值1.3.5 药物最小杀菌浓度 MBC 测定分别吸取 0.1 mL 未见微生物生长的各试管中的培养物，移种于不含药的营养琼脂培养基中，置于恒温箱，细菌培养1620 h，真菌培养3240 h，观察有无微生物生长 以平皿培养基中无微生物生长的药物浓度作为该中草药提取物的 MBC 值1.4 数据处理方法用SPSS Statistics17.0软件中的成对样本检验进行数据统计分析，显著性检验水平P0.05为显著，显著性检验水平 P0.01 为极显著 采用 OriginPro 2022 软件绘制柱状分析图表第 2 期67朱君，等：4 种中草药提取液的工艺优化及抗菌效果对比研究2 结果与分析2.1 中草药提取的单因素优化试验本实验通过抑菌圈大小来优化衡量 4 种中草药有效抑菌物质的最佳提取条件 5种微生物中，细菌包括革兰氏阳性菌（枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌）及革兰氏阴性菌（大肠杆菌）；真菌包括单细胞真菌酵母菌和丝状真菌黑曲霉 5 个影响因素包括：提取时间、提取温度、乙醇浓度、料液质量浓度和提取溶液 pH图 1 提取时间对 4 种中草药抑菌效果的影响图 2 提取温度对 4 种中草药抑菌效果的影响由图1可知：不同提取时间下，4种中草药提取液对5种微生物的抑制效果并无显著差异 当提取时间为1040 min 时，黄连对大肠杆菌的抑菌效果无显著差异，抑菌圈达到 24 mm 左右 当提取时间为 10 min 时，五倍子对枯草芽孢杆菌抑制程度较高，抑菌圈达到 25.5 mm 提取时间对五倍子抑制金葡菌的效果无影响，抑菌圈约为 25.5 mm 对于白头翁来说，提取时间差异对其有效成分抑制黑曲霉生长效果也无显著影响，抑菌圈为 1315.5 mm 由差异显著性分析结果表明，延长提取时间并不能明显提高 4 种中草药有效抑菌成分在乙醇溶液中的浸出 若 4 种中草药在特定饲料添加剂配方中同时存在，综合考虑规模提取的时间成本，建议提取时间为 10 min由图 2 可知：不同提取温度下 4 种中草药提取物抑菌效果规律性不明显其中，黄连在 50 提取时，其对金葡菌、酵母菌和黑曲霉的抑制效果最好，抑菌圈直径分别为 24.5，16.0 和 15.5 mm随提取温度从 40 提高到 70，杜仲对酵母菌的抑菌效果逐渐减弱，抑菌圈从10.5 mm缩小到9 mm 五倍子受提取温度影响不明显，其中仅在 70 时对金葡菌的抑制效果最明显，达到 29 mm左右 白头翁对黑曲霉的抑菌圈直径呈现先增大后减小的趋势，但差异不明显 综合考虑，我们推荐 4 种中草药在 50 条件下提取有效抑菌物质由图 3 可知：在本实验条件下，当乙醇浓度为 60%时，杜仲对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌及黑曲霉的抑菌圈直径最大，分别为 17.5，22，10.5 和 9 mm 当乙醇浓度提高到 70%时，黄连对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径达到 28 mm，抑制效果最高 当乙醇浓度升高至 90%时，仅有五倍子对 3 种细菌的抑菌效果最好，但是提高乙醇浓度并没有影响真菌抑菌成分的提取效率 总体来说，提取溶剂中乙醇浓度的变化对这 4 种中草药抑菌效果的影响较小，故 4 种中草药的最优乙醇提取浓度为 60%70%常熟理工学院学报（自然科学）2023 年68图 3 乙醇浓度对 4 种中草药抑菌效果的影响图 4 料液质量浓度对 4 种中草药抑菌效果的影响图 5 提取溶剂 pH 对 4 种中草药抑菌效果的影响由图4可知：4种中草药中5种抑菌有效成分的提取过程对料液质量浓度变化不敏感 当料液质量浓度为 166.67 g/L 时，五倍子有效成分对金葡菌、酵母菌及黑曲霉的抑菌圈最大，分别达到27，20和9.5 mm 当料液质量浓度降为 125 g/L 时，除五倍子对金葡菌的抑制以及杜仲、五倍子和白头翁对酵母菌的抑制效果外，与 166.67 g/L 时的抑菌效果相比，4 种中草药对 5 种微生物的抑菌效果有程度不等的提高，尤其是黄连对大肠杆菌的抑制、杜仲对枯草芽孢杆菌的抑制效果达到最佳，抑菌圈直径分别为 25 和26 mm 当料液质量浓度进一步降低到 100 g/L 时，仅有五倍子对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制效果最好，抑菌圈分别为 28 和 24 mm 综合考虑中草药和提取溶剂成本，黄连、杜仲、五倍子和白头翁的最优料液质量浓度为 125 g/L由图 5 可知：在本实验条件下，当溶液pH为2.0时，杜仲对枯草芽孢杆菌的抑制、五倍子对酵母菌的抑制、黄连对黑曲霉的抑制效果分别达到最好，其抑菌圈直径分别为 30，20 和 23.5 mm当溶液 pH 为5.0 时，五倍子对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果最好 不同 pH 的白头翁乙醇提取物对 5 种常见菌的抑制作用差异较小 故黄连、杜仲、白头翁乙醇提取物的最优溶液 pH为 2.0，五倍子乙醇提取物的最优溶液 pH 为 5.02.2 4 种中草药液对 5 种微生物的 MIC 和 MBC 结果60%70%80%90%第 2 期69朱君，等：4 种中草药提取液的工艺优化及抗菌效果对比研究如表 1 所示：4 种中草药对 5 种常见菌的 MIC 值在 7.8125 mg/mL，MBC值在 31.25250 mg/mL 其中对于细菌（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌）来说，黄连和五倍子对大肠杆菌的 MIC 值较小，均为 15.6 mg/mL，MBC值也对应较小，均为 62.5 mg/mL杜仲和白头翁对大肠杆菌的 MIC 值居中，都是 31.25 mg/mL而对于枯草芽孢杆菌来说，黄连和五倍子的 MIC 值最小，均为 31.25 mg/mL，MBC 值分别为 125 和 62.5 mg/mL