DNA_结构、链替换反应和反应网络_肖石燕.pdf

DNA:结构、链替换反应和反应网络肖石燕*,李成勖,梁好均*中国科学技术大学化学与材料科学学院,精准智能化学重点实验室,合肥 230026同等贡献*通讯作者,E-mail:;收稿日期:2023-01-07;接受日期:2023-02-20;网络版发表日期:2023-03-31国家重点研发计划(编号:2020YFA0710703)、国家自然科学基金(编号:22073090,21991132,52021002)、中国科学院青年创新促进会(编号:2022464)和中央高校基本科研业务费专项资金资助项目摘要DNA不仅是生物遗传信息的载体,更是一种可精确操控和设计、高度生物相容的高分子材料.由于DNA的特异性碱基互补配对和碱基序列的可编程性,人们设计了DNA链替换反应.基于链替换反应,可以构建链替换反应网络,实现特定的功能.本文综述了近年来在DNA结构和力学性质、链替换反应的微观机制和速率调控机制、反应网络构建和调控,及其在球形核酸自组装和细胞组装等方面的研究进展.最后,我们展望了DNA链替换反应网络未来研究和发展方向.关键词DNA,DNA力学性质,链替换反应,反应网络,自组装,细胞组装1引言脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)是生命体最重要的分子之一,作为遗传信息的重要载体,其存储着生命体的遗传密码1,并按照中心法则2,调控生物的生命活动.DNA是由腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)四种脱氧核糖核苷酸,通过氢键互补配对,以脱氧核糖(五碳糖)为骨架形成的双螺旋大分子.具有疏水性的碱基对,通过-作用彼此堆叠,置于分子的内侧;脱氧核糖和磷酸基团通过磷酸二酯键相连构成并排列在外侧.DNA有多种结构形态,比如A、B、Z等构型.其中,B-DNA双螺旋结构是最常见,也是生理环境中最普遍的构型.从高分子物理的角度上看,DNA是一种经典的模型高分子.DNA带有强负电,是一种典型的聚电解质大分子.DNA分子结构精细,其合成、修饰都比较简单,链长和序列可以精准设计和控制.对DNA,当其链长超过1000个碱基对(bp)时,人们可以采用蠕虫链(worm-like chain,WLC)来描述.在生理条件下,DNA的持续长度(persistence length)约为50 nm,即150 bp的长度.在不同的离子环境和离子强度下,DNA的持续长度会表现出显著的差异,范围在4080 nm3,4.当DNA链长足够长时,我们可以将其视为结构均一的高分子;而当链长较短时,其力学和构象性质的序列相关性将会被凸显出来.DNA的碱基互补配对特性和序列可编程性,使DNA的功能不再局限于作为遗传物质,同时也是一种理想的、可精准设计和控制的生物相容材料.See-引用格式:Xiao S,Li C,Liang H.DNA:structure,strand displacement and reaction network.Sci Sin Chim,2023,53:721733,doi:10.1360/SSC-2023-0006 2023 中国科学杂志社中国科学:化学2023 年第 53 卷第 4 期:721 733SCIENTIA SINICA C聚合物结构与性能专刊评 述man5于1982年创造性地提出,通过精确设计碱基序列,长链和短链DNA可以通过“退火”的方式组装,构建纳米器件.Seeman的思想为精确设计和构筑复杂纳米器件提供了基础.此后,基于DNA设计的各种复杂器件被成功构建出来,DNA折纸领域得到了蓬勃发展6.2000年,Yurke等7提出了一种被称为“toehold调控的链替换”的反应,在DNA双链的一端,保留一定长度的单链结合位点(toehold端,即黏性末端),溶液中的互补链可以与toehold端结合,启动分支迁移反应,将原本结合的保护链替换下来.基于链替换反应,人们可以构建各种复杂的反应线路,实现特定的功能,甚至与细胞的生理活动相结合,实现对细胞生理过程的调控.基于链替换反应的DNA动态反应网络在DNA计算、分子识别、重大疾病诊疗、信息存储、基因调控等方面具有潜在的应用前景810.本文回顾了近年来在DNA刚性、toehold链替换反应的微观物理机制、DNA链替换反应线路调控等方面的研究进展,并对DNA链替换反应线路调控的研究和应用前景进行展望.2短链DNA力学性质DNA的物理性质与其生理功能的完成密切相关,包括遗传信息存储、DNA折叠、转录等.因此,长期以来,DNA的物理性质是广受关注的研究课题11.对DNA,在链长大于1000 bp时,其精细的化学结构通常被忽略,DNA被视为性质均一的半刚性高分子11,其可以很好地使用高分子蠕虫链模型来描述.但是,DNA生物功能的完成,往往与其短链尺度的力学性质和构象转变密切相关.因此,近年来,DNA短链尺度的力学和构象转变性质受到了人们的广泛关注.通常,人们视碱基为刚性的平面结构.Raber等12发现,对含氮六元环结构柔顺性,非芳香性六元环从平面扭转到160非平面结构,所需要的能量仅为1.5 kcal/mol.更加直接的证据则来源于第一性原理分子动力学模拟.Leszczynski等13采用CPMD(Car-Parrinello mole-cular dynamics)对单个碱基的研究发现,在300 K的室温下,嘧啶环有30%的结构为非平面结构.肖石燕和梁好均14通过第一性原理分子动力学模拟,进一步研究了碱基对的构象柔顺性.他们发现,在孤立状态下,碱基嘧啶环的刚性与环的芳香性密切相关.T碱基的芳香性最小,其表现出的柔顺性最强;而A碱基的芳香性最强,刚性最大.5种碱基的刚性排序为:A G C U T,与其芳香性强弱是一致的.碱基对间的氢键相互作用同样会影响碱基柔顺性.碱基配对增强G、T和U的刚性,减弱A的刚性,对C则影响很小.Shishkin和Furmanchuk等15,16发现,碱基的柔顺性会受到周围溶剂的影响.在溶液中,G、C、T的刚性会增强,而A的刚性减弱.在生理条件下,碱基对间会发生质子转移,形成所谓的“亚胺-烯醇”(imino-enol)异构体.肖石燕和梁好均等17采用CPMD模拟,借助约束分子动力学和赝动力学(metadynamics)等稀有事件加强采样方法,第一次构建了室温下GC和AT碱基对质子转移的完整自由能面,他们发现GC和AT之间双质子转移能垒分别为14和7 kcal/mol.这些结果表明,组成DNA的碱基具有很强的柔顺性;在生理环境下,碱基对变异和异构体的存在对DNA局域结构和柔顺性描述提出了新的挑战.通常,DNA被默认为是一种非常刚性的聚电解质.通过单分子实验,在溶液中的持续长度测量值约为50 nm,即150 bp.但是,DNA实际力学性质则远比人们设想的理想情况要复杂得多.生物学方面的证据表明,短于150 bp的DNA片段也会发生大幅度的弯曲18.而在高分子物理的角度,当DNA链长小于持续长度时,人们通常认为DNA为刚性棒,是无法发生弯曲的.这个矛盾的现象,激发了人们对短链DNA力学性质研究的广泛兴趣.Wiggins、Vafabakhsh和Ha等19,20通过原子力显微镜和成环实验,发现短于100 bp的DNA链段能发生强弯曲,表现出强柔顺性.Noy和Golestanian21通过分子动力学模拟,发现DNA的扭转模量在小于1个螺旋周期时会突然减少.这些研究结果,对DNA的蠕虫链理想描述提出了挑战.为了解释DNA在短链尺度上的强柔顺性,人们引入了链段局域瞬时解离(“bubbles”)22、扭结(kink)23或者碱基对破缺(open-ing)24.但是,这些理论解释至今未获得明确的实验证据支持.部分理论和实验工作研究依然对DNA在短链尺度的强柔顺性持怀疑态度.比如,Mazur等25通过原子力显微镜测量了短链DNA的弯曲,提出DNA长度大于3个螺旋周期(10.5 nm)时,仍然符合蠕虫链理想模型描述.这些研究结果表明,DNA短链尺度的力学性质描述,依然存在争议;尤其是蠕虫链的长度适用极限,是值得关注的问题26,27.肖石燕等:DNA:结构、链替换反应和反应网络722为探讨蠕虫链模型在短链尺度DNA上的适用极限,肖石燕和梁好均等28发展了“中性”异构体模型.他们通过对比正常带电的DNA与其“中性”异构体在构象、刚性等性质上的差异,探讨了短链尺度DNA物理性质的链长依赖性.他们的研究结果表明,对“中性”异构体,在各个链段长度上,其弯曲角概率分布均可以很好地符合ln(P)(1cos)线性关系,其中为链段弯曲角度,P为概率.这表明,“中性”DNA在所有链长尺度上都可以很好地符合蠕虫链理想模型.而对正常带电DNA,在链长大于25 bp时,弯曲角概率分布ln(P)与(1cos)是线性相关的;短于25 bp时,ln(P)与(1cos)是偏离线性关系的,而且链长越短,偏离程度越大(图1)29.这表明,链长在短于25 bp时,DNA是偏离蠕虫链理想模型的,而骨架的静电排斥作用,正是导致短链DNA偏离蠕虫链理想描述的原因.这也可以认为,骨架静电排斥作用,是对DNA力学弹性的干扰;当链段越短时,骨架静电排斥作用影响越大.有趣的是,他们发现,相比于正常带电DNA,在大于2个螺旋周期时,“中性”异构体拉伸模量更小;而在小于2个螺旋周期时,“中性”异构体拉伸模量更大.这个现象说明,骨架静电排斥作用对DNA刚性的贡献,具有链长依赖性.与传统上认为骨架静电相互作用对DNA柔顺性的影响是均一性的观点相比,这些研究结果是新的认识和理解.DNA刚性的序列依赖性和离子环境对其结构和柔顺性的影响,也是人们关注的重要问题.在链长较长时,DNA可以被视为均一的高分子;当链长越短时,其结构和力学性质的序列特异性会被凸显出来.比如,人们发现,A-tracts序列对DNA的柔顺性有两个作用:(1)它会导致DNA的定向弯曲;(2)A-tracts自身会展现出较强的刚性30.肖石燕和梁好均等28发现,骨架静电排斥作用对DNA的影响也与序列相关.他们发现,DNA中性化会使GC序列刚性增强,AT序列刚性减弱.代亮、张兴华、谭志杰等31,32通过磁镊实验表明,当离子强度增强时,DNA扭转(twist)加剧,减小DNA半径.DNA序列与DNA高级结构(如DNA超螺旋)之间的关联,也是目前值得关注的问题.通常,人们认为DNA刚性来源于两部分贡献:碱基对间-堆叠作用和骨架静电排斥作用.这两种作用,谁对DNA的刚性起主导作用,一直存在较大的争议.Odijk、Skolnick和Fixman(OSF)33,34认为,静电相互作用对DNA持续长度的贡献不到10%.而Man-ning35则提出了正好相反的理论,他认为,DNA刚性主要由静电作用贡献.Papoian等36通过分子模拟,发现-堆叠和静电作用对DNA持续长度的贡献几乎相等.肖石燕和梁好均等29通过全原子分子模拟计算了全原子“中性”异构体和正常带电DNA的持续长度,发现静电相互作用对DNA持续长度的贡献为10%,与OSF的理论一致.对DNA分子,其短链物理性质依然是目前人们关注的焦点.短链DNA的构象柔顺性、结构转变等性质具有序列特异性,不仅与其局域生物功能相关,也与DNA高级形态、大尺度上的DNA折叠,以及染色质组装动力学等密切相关37.因此,短链DNA的物理性质,值得我们持续关注和深入研究.3DNA链替换反应微观机制3.1DNA杂交DNA杂交是两条游离的互补单链复合成双链的过程.其不仅是DNA生物功能的基本过程之一,也是DNA纳米器件构筑的基本步骤.对toehold调控的链替图 1(a)长度为63个碱基对的短链DNA;(b)DNA轮廓长度示意图(L0)、端到端距离(L)和弯曲角度();正常带电DNA片段(c)和中性异构体DNA片段(d)弯曲角度的概率分布,在中性异构体DNA片段中,骨架磷酸基团是中性的.计算中,DNA片段长度分别取值为5、15、25、35、45和55 bp29(网络版彩图)Figure 1(a)63 bp DNA oligomer;(b)sche