A型口蹄疫病毒与中和性抗体的复合物结构解析_张泽林.pdf

第 卷 第 期 年 月电 子 显 微 学 报 ，文章编号：（）型口蹄疫病毒与中和性抗体的复合物结构解析张泽林，武山权，李凤娟，泽让扎西，卢曾军，李 坤，雷东升（物理科学与技术学院 兰州大学电镜中心，兰州大学，甘肃 兰州；家畜疫病病原生物学国家重点实验室，兰州大学动物医学与生物安全学院，中国农业科学院兰州兽医研究所，甘肃 兰州）摘 要 口蹄疫病毒（，）是感染猪、牛、羊等偶蹄动物的烈性病原，严重危害畜牧业的发展以及相关产品的对外贸易。包含七个血清型，其中 型 抗原结构变异最大，因此解析 型 保守抗原结构对广谱疫苗分子设计具有重要指导意义。据此，本文作者利用冷冻电镜技术解析了 型 与中和性抗体 复合物的三维结构。发现 结合于 型 颗粒的三重轴附近，接触面多数氨基酸位于衣壳蛋白 环，其次是 环以及 “结节”上不连续的少量氨基酸。其中，的、与 位氨基酸通过氢键与抗体相互作用，可能是影响结合的关键位点。进一步的结合自由能分析支持该猜测，提示 位点是组成抗原表位的关键决定簇，而 和 突变则可进一步降低结合自由能从而提高与抗体的亲和力。结合自由能分析也说明了 具有较高的成熟度。研究结果揭示了 型 的抗原结构信息，为 疫苗分子设计提供了一个重要靶点。关键词 口蹄疫病毒；中和性抗体；冷冻电镜；结合自由能中图分类号：；文献标识码：收稿日期：；修订日期：基金项目：国家自然科学基金面上项目（）；兰州大学中央高校基本科研业务费学科交叉创新团队建设项目（）；“十四五”重点研发计划项目资助（）共同第一作者：张泽林（），女（汉族），山西人，硕士：武山权（），男（汉族），内蒙古人，硕士：通讯作者：雷东升（），男（汉族），河南人，教授：李坤（），男（汉族），河南人，副研究员：口蹄疫（，）是由口蹄疫病毒（，）引起的烈性疾病，主要流行于猪、牛、羊等家畜以及 多种野生偶蹄动物。可以通过空气和污染物传递，传播速度快，传播面积广，对幼年偶蹄动物致死率非常高，每年造成全球数百亿美元的损失，被视为最严重的跨界动物疾病之一。疫苗接种是预防 传播的重要手段，系统解析 抗原结构对疫苗分子设计具有重要指导意义。是一种无囊膜、单股正链 病毒，属于小 病毒科，病毒属。病毒衣壳由 种结构蛋白（、和）组成，其中、和 形成原体，暴露在病毒颗粒的外表面，因此这 种蛋白决定了病毒中和抗体的反应性，其上的抗原表位也成为了疫苗开发的重要靶点。由于 依赖的 聚合酶固有的易出错倾向，表现出高度的遗传和抗原多样性。它不仅有 种不同的血清型（、和），而且每种血清型都有大量且不断进化的亚型，。这使得针对不同血清型，甚至同一血清型的不同毒株之间的疫苗通常缺少有效的交叉保护。目前 的疫苗开发主要围绕分布范围最广的 型血清型，对其他血清型的研究较少。事实上，型血清型的流行范围和毒株复杂程度仅次于 型，不仅在世界各大洲均有出现，而且在发展中国家日趋严重。在我国，型 毒株于 年首次在武汉报告，随后在中国大陆的其他九个地区依次发现，已导致了严重的经济损失。因此对 型 的抗原表位，尤其是抗原抗体相互作用的关键氨基酸位点的解析有助于疫苗分子的设计。此前 型 衣壳蛋白抗原表位主要通过病毒中和逃逸突变株筛选进行鉴定，其表面的关键抗原决定簇包括 环的、和 位氨基酸，的、和 位氨基酸，以及 的 和 位氨基酸。近年 电子显微学报 第 卷来，冷冻电镜三维重构成为解析全病毒及病毒抗体复合物结构，鉴定抗原表位的重要方法。年清华大学与兰州兽医研究所创新团队合作，将该方法应用于 与一跨血清型中和性抗体 的复合物结构解析，发现 结合到病毒的二和五重轴间，并跨原体地与病毒 的、环以及 的 环相互作用，从而揭示了 型间保守中和抗原位点，为开发针对 的跨血清型通用疫苗提供了表位信息。同年该联合团队还通过冷冻电镜三维重构在内的多种研究手段，确认了一个可阻止 型 衣壳蛋白解离的五聚体间表位，且围绕中和性抗体在 血清型不同亚型之间的中和差异，提出了 突变可有助于开发广泛保护性疫苗的思路。本文利用冷冻电镜单颗粒三维重构方法解析了 型 与中和性抗体 的复合物结构，揭示了 型 抗原表位的结构信息，找到了形成氢键等相互作用的关键氨基酸位点，并通过深度学习算法评估了突变对结合自由能的影响，以此提出了病毒与抗体结合的结构基础。相关研究结果可为揭示 型 与抗体结合的机理、开发针对性的疫苗提供新的线索。实验方法 样品制备 采用超速离心和蔗糖连续梯度密度离心相结合的方法纯化 抗原。首先取 灭活的 病毒，离心 去除细胞碎片，加入 搅拌过夜，沉淀病毒。然后 离心 ，弃上清，沉淀病毒粒子用 缓冲液（，）重悬。然后取浓缩病毒加至 蔗糖溶液上，离心 ，沉淀病毒粒子用 缓冲液（，）重悬。然后加至 蔗糖连续梯度，离心 。然后从上至下以 管分层收集病毒，使用微量分光光度计测定 吸光值，取 大于 管层汇集病毒，使用脱盐（，）柱去除蔗糖，然后根据 约等于 进行 换 算，用 超 滤 管 浓 缩 抗 原至，。利用单个 细胞抗体技术，从免疫 疫苗猪的外周血 细胞中分离获得中和性抗体，具体方法见文献。该抗体能够中和我国当前流行的 谱系的 毒株和 毒株，为 谱系广谱中和性抗体。利用它鉴定出来的抗原结构在一定程度上代表着 型 的保守抗原结构信息。把抗体 基因的 和 片段采用柔性连接子连接，并在 端添加 标签（），设计单链抗体（，）分子，然后将优化后的 基因克隆到 表达载体中，获得单链抗体 表达质粒。将单链抗体表达质粒转染到悬浮的 细胞中。收集细胞上清，使用 蛋白纯化仪（），亲和层析纯化，进一步利用 色谱柱进行尺寸排除层析纯化。最后获得的抗体通过测定 吸光度值来定量浓度。使用 制备 复合物的冷冻样品。首先，将纯化后的 型 抗原与 抗体以 摩尔比混合并在冰上孵育。随后，将 混合液滴加于亲水化处理后的 金载网上，用滤纸去除载网上多余的溶液，并在 湿度和 下利用 快速冷冻样品。最后，将制备好的冷冻样品转移到液氮罐中储存。数据采集 使用配备 直接电子探测器的 冷冻电镜采集数据。利用 软件的超分辨模式，放大倍数，像素尺寸 ，欠焦范围 ，累积电子剂量 。数据预处理 使用 对所有原始图像进行预处理。首先，调用 对图像进行漂移校正，过程中设置 为。随后，调用 对衬度传递函数进行拟合。最后，检查经过预处理的图像，剔除漂移过大、有污染或像散较大的图像，最终保留 张图像供下一步的单颗粒重构。单颗粒重构 使用 进行单颗粒重构。首先，手动挑选 个颗粒进行二维分类，并将其中对称性较好的分类作为模板进行颗粒的自动挑选。过程中调整参数以避免晶体冰、碳膜和团聚等的影响，最终挑选出 个颗粒。然后，通过多轮二维分类从这些颗粒中筛选出 个高质量颗粒，并基 第 期张泽林等：型口蹄疫病毒与中和性抗体的复合物结构解析 于它们生成低分辨率初始模型。随后，通过多轮三维分类以挑选分辨率最佳的 个颗粒，在此过程中进行了模型的自动优化、衬度传递函数的优化、贝叶斯抛光。最后，进行埃瓦尔德球校正与 因子锐化以生成最终的电子密度图。期间产生的所有电子密度图均使用金标准傅里叶壳相关性 评估分辨率。由于病毒颗粒倾向于聚集（如图 所示），为了尽量提高三维重构的分辨率，本文在上面的二维分类和三维分类过程中扔掉了大部分聚集的病毒颗粒。颗粒的聚集很有可能是由 的疏水作用导致。是类似于 的 分子，理论上 个 分子仅结合一个病毒颗粒。但在制备灭活 和 复合物时，与加入等体积 相比，可观察到的病毒颗粒会大量减少，这种现象的原因并非抗体 破碎了病毒粒子（没有鉴定到病毒 的释放），而有可能是 通过疏水作用使病毒聚集。这一现象与先前发表文献制备 抗体复合物时的现象相似，有待进一步从其他角度思考与验证。模型构建 与 的初始模型分别取自病毒的晶体结构（）以及 的预测，。利用 将 与 的初始模型对齐到复合物的电子密度图中，随后使用 对原子模型进行实空间优化。使用 手动调整优化后的模型以使其与电子密度图更匹配，并重新使用 对原子模型坐标进行实空间优化，最后使用 中的 程序对模型进行验证。突变对病毒抗体结合自由能的影响 使用 分析 与 间的相互作用（截断距离 ），比对不同血清型 的序列，并利用 生成序列对比图。随后，使用 对 或 结构进行氨基酸的单点突变，并利用 对突变后的结构进行能量最优化，最后使用 计算该突变引起的结合自由能变化。结果与讨论 型 复合物结构 为了确定 型 与中和性抗体 的结合位点，作者将高度纯化的 与 混合孵育，随后将混合物制备成冷冻样品，接着采集电子显微图像，并对图像进行单颗粒重构以解析出 复合物的电子密度图（分辨率 ，如图 所示）。图 复合物结构的冷冻电镜三维重构。复合物电子显微图，；二维分类显示出病毒颗粒外表面的抗体，；复合物电子密度图的半径着色图像，；使用金标准傅 里叶壳相关性（）评估出 复合物分辨率 。，；，；，；（）电子显微学报 第 卷 复合物的密度图显示 颗粒与 结合后仍呈现二十面体对称性。其衣壳部分由 种结构蛋白（、和）构成一个基本单元。其中、和 位于病毒表面，形成 个原体，则完全处于病毒内部。个原体组成一个完整的二十面体病毒颗粒，每个病毒颗粒上结合 个 分子，其中每 个 以 对称性结合在二十面体衣壳的三重轴附近。为了分析 与抗体 结合的抗原表位，作者根据电子密度图构建了复合物的原子模型（结构评估如表 所示），并分析了 与 间的相互作用。结果显示，不仅在一个原体内通过 环的残基、，的残基、，环的残基，的残基 以及 环的残基，与 重链的残基、和轻链的残基、相互作用，而且在另一个原体内通过 “结节”的残基 与 重链的残基 和轻链的残基 相互作用（如表 和图 所示），即 型 与 具有跨原体的相互作用。值得一提的是，环的 残基与 的 残基形成氢键，环的 残基同时与 的、和 残基形成氢键，环的 残基与 的 残基形成氢键；的 和 残基与 的 和 残基形成氢键；环的 残基与 的 残基形成氢键；环的 残基同时与 的 和 残基形成氢键。这些参与氢键相互作用的残基很可能是 与 结合的重要位点。尤其是 的、残基可分别与 形成至少两个氢键，与 形成一个氢键的同时具有疏水相互作用，这三个残基很可能是 识别 颗粒表面的关键抗原决定簇。表 与 的相互作用，氢键与疏水相互作用分别用蓝色和黑色显示 ，病毒抗体结合自由能与抗体的成熟度 通过对 复合物结构的分析，作者找到了影响两者结合的潜在关键位点，即 的、和。为了进一步确认这些位点对 结合 的贡献，尤其是寻找调控 与 结合的思路，利用深度学习算法计算了 不同突变对 结合自由能的影响。鉴于甘氨酸侧链仅为一个氢原子，因此可利用 第 期张泽林等：型口蹄疫病毒与中和性抗体的复合物结构解析 图 复合物的结构。中两个原体与 的相互作用。子图中橙色和青色部分分别是原体 和原体 中参与相互作用的残基；环和 环与 和 的氢键相互作用；和 环与 和 的氢键相互作用。残基之 间的氢键用黑色虚线表示。，；突变为甘氨酸的自由能变化评估相应残基对 结合自由能的贡献。结果显示，当把、和 分别突变为甘氨酸后，结合自由能分别升高了 、和 （如表 所示），说明这三个氨基酸的确对 的结合具有重要贡献。为了探究进一步提高 与 亲和力的途径从而为疫苗开发提供线索，作者将 的、和 分别突变为其他 种氨基酸（如表 所示），以期找到明显降低结合自由能的途径。结果表明，的所有突变都会导致结合自由能上升（突变破坏了原有的氢键网络），即 与病毒的亲和力下降，因此 应是病毒与抗体结合的关键位点，是组成抗原表位的核心决定簇。而 突变在将原有的与抗体 的氢键转为疏水相互作用的同时，增强了与抗体 间的疏水相互作用，使结合自由能降低 。突变则在保留了原有的与抗体 氢键的基础上，将与抗体 的氢键转化为疏水相互作用，使结合自由能降低 （如图 所示）。因此 和 应具有辅助抗体结合的功能，推测 和 两个突变能提高 型 的抗原性，有利于其对 类型中和性抗体的识别及亲和力提升，从而为 型 抗原疫苗毒株优化提供思路。利用深度学习算法，作者还计算了抗体 的几个重要结合位点（、和 ）的突变对结合自由能的影响，以评估 的