CART基因启动子双荧光素酶重组载体构建_高艳萍.pdf

中国牛业科学 2023，49(1):25-29China Cattle Science科学试验CAT 基因启动子双荧光素酶重组载体构建高艳萍1，任静2，李鹏飞2*(1 山西省忻州市繁峙县农业农村局，山西 繁峙 034300;2 山西农业大学生命科学学院，山西 太谷 030801)摘要:可卡因苯丙胺调节转录肽(cocaine-and amphetamine regulated transcript peptides，CAT)是一种内源性神经肽，广泛分布于中枢神经和外周神经系统。CAT 具有多种不同的生理功能，在牛繁殖机能研究中发现，CAT 还可以通过影响雌激素分泌抑制卵泡发育。这一发现为深入分析牛卵泡闭锁以及提高母畜繁殖率提供理论依据。然而 CAT 基因转录调控机制尚不明确。研究利用 pGL3 系列萤火虫荧光素酶表达载体，Mlu I、Xho I 双酶切割牛 CAT 基因启动子 475 bp+22 bp 区域，成功构建重组质粒，转染 293T 细胞，检测相对荧光活性，为后续筛选 CAT 基因核心启动子活性片段创造条件，进而为 CAT 转录调控分子机制的探究奠定基础。关键词:CAT;双荧光素酶报告基因;启动子;转录调控中图分类号:Q782文献标识码:A文章编号:1001-9111(2023)01-0025-05收稿日期:2022-10-14修回日期:2022-12-10基金项目:山西省应用基础研究计划面上项目(20210302123380);山西农业大学校地合作项目(2021HX23，2022HX010);山西省现代农业产业技术体系建设专项作者简介:高艳萍(1990)，女，本科，农艺师，主要从事农业服务工作。*通讯作者:李鹏飞(1978)，男，博士，教授，主要从事动物生殖生理方面的研究。可卡因苯丙胺调节转录肽(cocaine-and am-phetamine regulated transcript peptides，CAT)是一种广泛分布于中枢神经系统与外周神经系统的内源性神经肽。目前鼠、牛、绵羊和人的 CAT 基因已经研究的较为深入，它们均由 3 个外显子和 2 个内含子组成，CAT 基因在各物种间高度保守。牛的CAT 基因与大鼠的 CAT 基因核苷酸序列同源性为 85%，氨基酸相似度达 86%;而与人的 CAT 基因度为 90%，氨基酸序列同源性更是高达 97%1。CAT 参与摄食和体重调节、激素内分泌调节、感觉处理以及药物成瘾等相关生理功能;课题组前期研究发现，CAT 作为一种下丘脑分泌的神经肽，通过抑制雌激素分泌，在牛卵泡发育中发挥重要负调控作用。而转录是基因表达核心步骤，NA 聚合酶识别启动子序列并与启动子、DNA 双链特异性结合，启动子附近的 DNA 双链解旋并解链，促使底物核糖核苷酸与模板 DNA 碱基互补配对;之后进行延伸，直到转录终止位点转录终止2。转录的起始是基因表达的重要阶段，NA 聚合酶与启动子的相互作用是这个阶段的关键。启动子是位于结构基因 5端上游的一段 DNA 序列，它的结构会影响与 NA聚合酶的亲和力，从而影响基因的表达起始。启动子由核心启动子、上游元件、起始子和应答元件组成，它们与相应转录因子相互识别，发挥着转录调控作用，对基因进行调控从而应对生物体内不断变化的内环境。CAT 基因的转录受多种因子共同调节，其转录调控机制的研究目前已经取得部分研究成果，根据已经分离出来的小鼠 CAT 启动子序列推断出，CAT 前启动子包含 TATAbox、AP1、SP1、SP2、E-box 位点和 cAMP 反应元件等对于基因表达调控的研究至关重要3，而在牛 CAT 基因转录调控机制尚不清楚。研究通过将 pGL3 系列萤火虫荧光素酶表达载体与牛 CAT 基因启动子 475 bp+22 bp 区域连接，构建重组质粒，鉴定目的区域启动子活性，为后续筛选牛 CAT 基因核心启动子活性片段创造条件，进而为牛下丘脑 CAT 转录调控分子机制的探究奠定基础。1材料与方法1 1主要材料pGL3 系列萤火虫荧光素酶表达载体、内参pL-TK 载体(Promega，美国);HEK-293T 细胞株(Gibco，美国)、胎牛血清(FBS)(ScienceCell，美国)、胰蛋白酶(索莱宝，北京)、TransIntroTMEL(全式金，北京)、限制性内切酶 Mlu I、Xho I(Takara，日本)、DH5 感受态细胞(康为世纪，北京)。1 2试验方法1 2 1目的片段获取与载体构建根据 NCBI 数据库中牛 CAT 基因序列，选取 CAT 基因 CDS 区前 475 bp +22 bp 核苷酸序列，全长497 bp;并在 5端加入 Mlu I 酶切位点，在3段加入 Xho I 酶切位点，由上海吉玛公司合成。将目的片段链接于pGL3-Basic 载体上，酶切反应条件如下:10 Buffer添加 5 L，Mlu I 限制酶、Xho I 限制酶各 1 L，DNA5 L，ddH2O 38 L;于37 条件下反应2 h，构建重组质粒，命名为 pGL3 497。获得 pGL3 497、pGL3 Control、pGL3 Basic 空白组萤火虫荧光素酶报告载体和 pL TK 海肾荧光素酶载体。1 2 2连接产物转化感受态细胞将双荧光素酶系列载体和海肾荧光素酶载体重组质粒转化大肠杆菌 DH5，LB 培养基中加入卡那霉素溶液，混合摇匀。冷却后表面用玻璃棒将 X-gal 和 IPTG 涂抹均匀，培养箱中放置 3 h。50 L DH5 感受态细胞中添加 5 L 重组产物，置于冰上静置 30 min，42 水浴 30 s，再静置3 min，加入无抗生素的 LB 液体培养基在摇床振荡培养 45 min;再将菌液涂布于富含卡那霉素的 LB 固体培养基中，恒温培养 10 h。观察蓝白斑菌落，挑取蓝白菌落中多个单一白色菌落置于培养基中，在 37 恒温摇床振荡过夜，将部分菌液送至生工生物工程(上海)有限公司测序。使用E Z N AEndo-Free Plasmid DNA Mini Kit 去内毒素质粒提取试剂盒进行质粒抽提，获取重组质粒，用于后续 293T 细胞的转染。1 2 3细胞培养与转染复苏冻存的 293T 细胞，将细胞接种于含 10%胎牛血清(FBS)高糖 DMEM培养基中，在 37、5%CO2培养箱中培养。将细胞按照 2 5 104个/孔接种于 24 孔板，培养 12 h后，细胞密度为 70%80%时将完全培养基换成无血清培养基后进行转染。取8 L pGL3 系列质粒、2L 内参基因 pL-TK 质粒与 50 L DMEM 培养基混匀，取 2 4 L TransIntroTMEL 转染试剂与 50 LDMEM 培养基轻轻混匀，室温静置 20 min。12 4荧光素酶报告基因活性检测细胞转染 48h 后，用 PBS 清洗 2 次后，加入报告基因细胞裂解液，裂解30 min;离心去沉淀，添加100 L 萤火虫荧光素酶检测液，560 nm 波长下测定荧光活性;添加100 L 海肾荧光素酶检测工作液并在 465 nm 波长下检测荧光活性;两值之比即为荧光素酶的相对活性。数据结果通过 GraphPad Prism 9 0 软件进行单因素方差分析。2结果与分析2 1重组质粒的鉴定Mlu I、Xho I 双酶切割 CAT 启动子片段，构建CAT 启动子 497 bp 目的片段，链接于质粒 pGL3-Basic 多克隆位点，转化 DH5 感受态细胞，构建重组荧光素酶报告基因质粒，测序结果如图 1 所示，表明报告基因表达载体构建成功。图 1重组质粒测序部分图谱2 2HEK 293T 细胞转染效果检测细胞培养至密度达 70%80%时进行细胞转染如图 2a，观察 293T 细胞转染 pGL3 系列质粒和pL-TK 质粒48 h 后如图2b，细胞状态良好，绿色荧光蛋白分布均匀且荧光强度适中。62中国牛业科学第 49 卷图 2293T 细胞转染效果(10 )2 3牛 CAT 基因截断启动子片段活性分析成功构建双荧光素报告载体转染293T 细胞，经过 48 h 后双荧光素酶报告基因系统检测启动子片段相对荧光活性，结果如图 3 显示，pGL3-Control 相对荧光活性极显著高于 pGL3-Basic 组与 pGL3-497组，表明细胞成功转染，双荧光素酶表达处于正常水平。pGL3-497 的相对荧光活性显著高于 pGL3-Bas-ic，表明在牛 CAT 基因启动子 475 bp+22 bp区域内具有转录活性。图 3牛 CAT 基因 5端缺失启动子片段相对荧光活性检测3讨论CAT 最初于 20 世纪中后期，由 Spiess 等人4 在羊下丘脑中分离出来，但并未对其进行功能上的研究。直到 1995 年，Douglass 等5 发现给大鼠注射精神兴奋性物质后，大鼠血清中 CAT 水平急剧升高。目前已知大鼠脑室、肠道、肾上腺中都含有CAT 肽6。在大鼠、小鼠、以及鱼类等物种广泛研究发现，CAT 大量存在于摄食调节的下丘脑神经核中，可以抑制摄食7。研究证明给大鼠注射CAT，不仅可以抑制摄食，而且还会使其产生条件性味觉厌恶8。研究者认为 CAT 可能在下丘脑控制区和后脑运动以及化学感应区两个水平上达到控制摄食的效果9。CAT 肽在药物成瘾以及药物诱导的奖赏及强化效应方面得到广泛研究。Brunetti等10 发现，不同剂量的 CAT 肽会使下丘脑神经末端阻断多巴胺的释放，并且具有较高敏感性。Ja-worski 等11 研究证实 CAT 肽参与 VTA-NAc 通路的调节，从而调节精神兴奋性药物的效应。Koylu等12 利用免疫组化法检测 CAT 肽免疫活性分布，发现在伏隔核以及杏仁核中呈阳性，意味着其在药物诱导的奖赏及强化效应中发挥重要作用。另外，CAT 可以促进激素的释放，从而影响内分泌。CAT 能够刺激体外培养的下丘脑细胞释放促肾上腺皮质激素释放激素13。大鼠脑室注射 CAT 肽会造成体内催产素水平短暂升高，皮质酮、血糖水平显著升高14。内分泌激素的变化同时会影响体内卵泡的正常生长、发育和成熟。美国密歇根州立大学在牛卵巢中发现 CAT 基因并对其进行研究，首次证实了 CAT 基因在哺乳动物繁殖机能方面的功能。研究表明，CAT 基因经过转录、翻译，在下丘脑神经元内由核糖体合成无活性的 CAT 前体，再通过内质网、高尔基体加工成熟后分泌到细胞外，通过下丘脑垂体卵巢轴抑制雌激素分泌和牛卵泡颗粒细胞增殖15。一定浓度范围的 CAT 肽能够抑制牛卵巢卵泡的正常发育，从而导致牛卵泡闭锁。李玲玉等16 采用无血清培养体系培养水牛卵巢颗粒细胞，探究促卵泡激素浓度对颗粒细胞中雌激素分泌的作用，发现外源CAT 抑制促卵泡激素诱导颗粒细胞合成与分泌雌二醇。李鹏飞等17 发现，在促卵泡激素浓度一定的条件下，雌二醇的分泌随 CAT 的增加而减少，这表明 CAT 可能对卵巢卵泡颗粒细胞的增殖起抑制的作用。经过对牛优势卵泡与从属卵泡进行转录组、蛋白组测序发现，CAT 对牛卵泡发育有明显的抑制作用，是引起牛卵泡闭锁的重要因素18。课题组前期研究发现 CAT 作为一种下丘脑分泌的神经肽，通过抑制雌激素分泌，在牛卵泡发育中发挥重要负调控作用。后续深入挖掘 CAT 在牛卵泡发育中的功能，可为进一步分析牛卵泡闭锁以及提高单胎家畜排卵率，提高母畜繁殖率奠定理论基础，然而目前对牛 CAT 基因转录调控机制却尚无报道。72第 1 期高艳萍，等:CAT 基因启动子双荧光素酶重组载体构建启动子含有基因表达调控重要的信息，用来控制基因表达的起始与程度。真核生物的启动子起始涉及多种蛋白因子与各种顺式作用元件的结合，启动子上富含调控元件的区域与转录因子结合，能够增强启动子表达活性，因此筛选活性较强的启动子片段，预测其转录因子结合位点，确定核心启动子区域对于基因表达调控的研究至关重要。本研究通过克隆牛 CAT 基因启动子片段，利用双荧光素酶报告基因系统鉴定启动子片段的活性，从而筛选核心启动子片段，为后续进一步探究牛 CAT 基因