Box-Behnken响应面法优化赤芍多糖的提取工艺_王文■.pdf

2023 年第 4 期工程师园地赤芍为毛茛科植物芍药（Paeonia lactiflora Pall.）或川赤芍（Paeonia veitchii Lynch）的干燥根 1，始载于 神农本草经，是中医常用的药物。赤芍性微寒，味苦，具有清热凉血、散瘀止痛的功效2。赤芍常用于中药复方中，可用于治疗角膜混浊和视力障碍，肝病和软骨病疼痛，痛经等3。多糖具有抗炎、抗癌、抗肿瘤、抗氧化和降血糖等药理作用4。目前对于赤芍多糖活性的研究较少。杜妹玲5研究发现赤芍多糖对于-葡萄糖苷酶及非酶糖基化终产物和乙酰胆碱酯酶有一定的抑制能力，其中抑制前两种物质能够起到降血糖及抗糖尿病的作用，而临床上乙酰胆碱酯酶抑制剂被用于治疗阿兹海默症，推测赤芍多糖能够起到调节内分泌系统和保护神经系统的作用。张伟杰 6等研究发现赤芍多糖在高浓度下促进人永生化表皮细胞生长，低浓度促进小鼠胚胎成纤维细胞生长，并且具有一定的抗菌活性。目前，赤芍的研究多数集中在其主要有效成分Box-Behnken 响应面法优化赤芍多糖的提取工艺*王文a，王韫格b，张洪财b，孟祥才c（黑龙江中医药大学 a.附属第一医院；b.中医药研究院；c.GAP 中心，黑龙江 哈尔滨 150040）摘要：目的 确定赤芍多糖的最佳提取条件。方法 采用苯酚-硫酸法显色，紫外可见分光光度法（UV）在 490nm 波长处测定当归多糖的吸光度，以赤芍多糖得率为指标，采用单因素和 Box-Behnken 响应面法优化实验条件。结果 当归多糖的最佳工艺参数为：料液比 1 20.84（g mL），回流时间为 157min 5s、回流次数 3次。结论 最佳提取条件下获得的平均赤芍多糖得率为 8.070%，与理论值之间的误差为 0.36%，说明将Box-Behnken 法应用于水提赤芍多糖工艺的优化是可行的，可用于赤芍多糖的提取。关键词：赤芍多糖；提取工艺；响应曲面分析；Box-Behnken；中图分类号：O657.72；R284.2文献标识码：AOptimize the ultrasonic extraction process of radix paeoniae rubra polysaccharideby Box-Behnken response surface method*WANG Wen-rana，WANG Yun-geb，ZHANG Hong-caib,MENG Xiang-caic（a.First Affiliated Hospital;b.Institute of Traditional Chinese Medicine;c.GAP Center,Heilongjiang Universityof Chinese Medicine，Harbin 150040，China）Abstract:OBJECTIVE To determine the best extraction conditions of Paeonia lactiflora polysaccharide.METHODS The absorbance radix paeoniae rubra polysaccharide was measured at 490nm by phenol-sulfuric acidchromogenesis and UV spectrophotometry,and the experimental conditions were optimized by single factor andBox-Behnken response surface method using the yield of radix peaoniae rubra polysaccharide as the index.RESULTS The optimal process parameters for the extraction of radix paeoniae rubra polysaccharide were:material-liquid ratio 1 20.84 g mL-1,reflux time 157min 5s,and reflux times 3 times.CONCLUSION The average yield ofradix paeoniae rubra polysaccharide obtained under the optimal extraction conditions was 8.070%,and the error between it and the theoretical value was 0.36%,indicating that it is feasible to apply the Box-Behnken method to optimize the process of aqueous extraction of radix paeoniae rubra polysaccharide,which can be used for the extraction of radix paeoniae rubra polysaccharide.Key words:radix paeoniae rubra polysaccharide;extraction process;surface response methodology;Box-Behnken;DOI：10.16247/ki.23-1171/tq.20230488收稿日期：2022-05-13基金项目：国家自然科学青年基金项目（81803711）；黑龙江省自然科学青年基金项目（QC2018118）；黑龙江中医药大学“优秀创新人才青年教师支持计划”项目（2018RCQ09）作者简介：王文（1985-），女，主管药师，博士研究生在读，研究方向：中药药效物质及质量控制的研究。通信作者：孟祥才（1968-），男，研究员，博士研究生，研究方向：药用植物生物学及质量评价。Sum 331 No.4化学工程师ChemicalEngineer2023 年第 4 期2023 年第 4 期水平因素料液比/g mL回流时间/min回流次数/次-11 15120101 20150211 201803表 1Box-Behnken 试验因素与水平Tab.1Factors and levels of Box-Behnken experiment王文等：Box-Behnken 响应面法优化赤芍多糖的提取工艺赤芍总苷及其生物活性的研究，对于多糖类提取工艺、分离纯化、结构表征、生物活性等方面的研究均较为罕见。为此，本文将对赤芍多糖的提取条件展开深入研究，首次运用响应面优化法，研究水提醇沉法对提取赤芍多糖的最佳工艺条件，力求达到一个高得率、高质量的赤芍多糖的提取工艺，为今后赤芍多糖研究奠定基础。1实验部分1.1材料与试剂中药材赤芍：购于黑龙江中医药大学附属第一医院，提取前将赤芍药材干燥后粉碎成干粉，样本保存于中医药研究院。无水乙醇（AR 天津市北辰方正试剂厂）；苯酚（AR 天津奥普升化工有限公司）；D（+）-无水葡萄糖标准品（20mg，批号：20211012，成都乐美天医药科技有限公司）。1.2仪器与设备SHSL 型调温电热套（上海树立仪器仪表有限公司）；R2003KB 型旋转蒸发仪（SENCO 科技有限公司）；AL204 型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；DZF-6020MBE 型鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；SHB-型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；UV-1800 型紫外-可见分光光度计（岛津企业管理有限公司）；DK-98-1 型超级恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；旋涡混合器（杭州齐威仪器有限公司）。1.3糖含量标准曲线的建立采用“苯酚-浓硫酸法”进行测定7。葡萄糖标准溶液的配制取 8.8mg 葡萄糖标准品，加蒸馏水定容至 200mL 容量瓶中，获得质量浓度为 0.044mg mL-1的葡萄糖标准品溶液。检测波长的选择取 2mL 的葡萄糖标准溶液，加 6%苯酚试液 1.0mL，摇匀，均匀滴加 H2SO45.0mL，摇匀，静置 10min，再置沸水浴中加热 15min，取出，冷却至室温，在 200600nm 扫描。结果在 490nm 波长处有最大吸收，故选择 490nm 为检测波长。标准曲线的制备分别先依次精密吸取该标准溶液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL，加蒸馏水补充至 2.0mL，照上述苯酚-硫酸法操作。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，以吸光度值（Abs）为纵坐标，得到回归方程：y=13.846x+0.1991，r2=0.9992。试验结果表明，浓度在 0.00440.0396mg mL-1的范围内曲线线性良好。样品的测定精密称取提取的干燥恒重赤芍多糖 100mg，置于干燥量瓶中，蒸馏水补充至 100mL，即得质量浓度为 1mg mL-1的供试品溶液，使用时稀释 31 倍。按照检测波长下的操作配制样品溶液，于490nm 处测定其吸光度。1.4赤芍多糖测定与计算赤芍多糖得率/%=cVDm/W1W100%式中c：供试品溶液中多糖浓度，mg mL-1；V：供试品溶液体积，mL；D：稀释倍数；m：赤芍粗多糖质量，g；W1：取供试品用于溶解的质量，mg；W：药材重量，g。1.5水提醇沉法提取赤芍多糖工艺路线药材根茎粉碎，取 10.00g 药材置于干燥的 250mL圆底烧瓶中，以料液比为 1 20（g mL）加入蒸馏水，置于恒温电热套上加热回流提取赤芍多糖，溶液微沸有液体开始回流时计时 120min，提取 2 次，过滤，滤液于 55下旋转蒸发减压浓缩至 20mL。加入 4倍量即 80mL 无水乙醇，充分搅拌，4下静置 24h。收集沉淀，于 80鼓风干燥箱中烘干后粉碎，可得赤芍粗多糖粉末。1.6单因素实验（1）料液比对赤芍多糖得率的影响料液比设定为 1 10、1 15、1 20、1 25、1 30（g mL），回流时间120min，回流次数为 2 次，平行试验 2 次。（2）回流时间对赤芍多糖得率的影响 回流时间设定为 60、90、120、150、180min，料液比为 120（g mL），回流次数为 2 次，平行试验 2 次。（3）回流次数对赤芍多糖得率的影响 回流次数设定为 1、2、3、4 次，料液比为 1 20（g mL），回流时间为 150min，平行试验 2 次。1.7赤芍多糖提取工艺的 Box-Behnken 响应面试验根据单因素实验的结果，以料液比（A）、回流时间（B）、回流次数（C）3 个影响因素为自变量，以赤芍多糖得率为响应值 Y，采用响应面法Design-Expert12.0 软件设计三因素三水平 Box-Behnken 实验优化提取工艺。Box-Behnken 试验因素及水平见表 1。892023 年第 4 期表 2响应面试验结果Tab.2Response surface test results组别（A）液料比/mL g（B）回流时间/min（C）回流次数/次Y-赤芍多糖得率/%12515012.6622518024.1832012035.93172015025.9642015025.8952515037.562018037.4472015026.0281518023.9192018012.28101515012.06111512023.17122012011.67132512023.79142015025.73151515036.74162015026.16王文等：Box-Behnken 响应面法优化赤芍多糖的提取工艺2结果与讨论2.1单因素考察结果2.1.1料液比的优化结果料液比优化结果见图 1。由图 1 可见，随着料液比中液体占比的增加，赤芍多糖的提取率也随之增加，这是由于提取溶剂少时，药材与溶剂接触不充分并且细胞内外的浓度差较小，不利于多糖分