2019-2021年广东省...毒流行情况及其分子分型研究_杨康.pdf

第 39 卷 第 2 期 2 0 2 3 年 3 月病 毒 学 报CHINESE JOURNAL OF VIROLOGYVol.39No.2March 202320192021年广东省严重急性呼吸道感染病例中鼻病毒流行情况及其分子分型研究杨康1，2，谢家敏2，3，黄鑫鑫2，3，邓慧诗2，4，李柏生2，5，武婕2，5*，邹丽容2，5*（1.中山大学 公共卫生学院，广州 510000；2.广东省疾病预防控制中心，广州 510000；3.南方医科大学 公共卫生学院，广州 510000；4.暨南大学 基础医学与公共卫生学院公共卫生与预防医学系，广州 510000；5.广东新发突发传染病防治工作站，广州 510000）摘要：分析广东省人鼻病毒（Human rhinovirus，HRV）的流行情况和型别分布情况。选取了 2019 年 1 月至 2021 年12月收集的 1959份 SARI病例的咽拭子标本，采用呼吸道多病原检测和巢式 PCR的方法进行 HRV 的检测和分型，使用 SPSS 26.0 软件分析 HRV 的流行分布，使用 MEGA11 等软件对 HRV 进 行 分 型 和 亲 缘 关 系 的 研 究。共收集 1 959例严重急性呼吸道感染病例（Severe acute respiratory infection，SARI），其中男性为 1 205例，女性为 754例。婴幼儿组阳性检出率最高，随着年龄的增长，鼻病毒的阳性检出率会下降。2020年鼻病毒阳性率仅在 6月份有一个高峰期，2021年鼻病毒阳性率在 4月份和 10月份有两个高峰期。人鼻病毒合并其他病毒检出的病例有 25例，检出率为 12.31%，与人副流感病毒和人冠状病毒的合并检出最为常见。203份鼻病毒阳性样本共获得 114条 VP4/VP2序列，分型鉴定结果显示 HRVA 型 68株，HRVB 型 8株，HRVC 型 27株，HRVA 和 HRVC 是广东省 HRV 流行的主要型别。婴幼儿是 HRV 感染的高发人群，HRVA1和 HRVC15是广东省 HRV 感染的优势基因型。另外，学校开学导致的学生聚集现象是鼻病毒检出率上升的重要原因之一。关键词：鼻病毒；严重急性呼吸道感染病例；系统进化树中图分类号：R373.1 文献标识码：A 文章编号：10008721（2023）02036408DOI：10.13242/ki.bingduxuebao.004294急 性 呼 吸 道 感 染（Acute respiratory infection，ARI）是增加 10 岁以下儿童疾病负担的主要原因之一，引起急性呼吸道感染的病原体主要有流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和人鼻病毒等1。婴幼儿最容易感染鼻病毒，在成人中出现哮喘急性发作和慢性阻塞性肺疾病急性加重（Acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）的症状时，经常观察到人鼻病毒的感染2。中国于2009 年开始实施了住院严重急性呼吸道感染病例监测项目（卫办疾控函 2009 1031 号），2009-2019的监测结果显示人鼻病毒的阳性检出率为 16.7%，仅次于流感病毒和呼吸道合胞病毒3。人鼻病毒于 20 世纪 50 年代首次被发现，一直以来都被认为是普通感冒的主要病原体。人鼻病毒属 于 小 RNA 病 毒 科（Picornaviridae）肠 道 病 毒 属（Enterovirus）。依 据 目 前 国 际 病 毒 分 类 委 员 会（International committee on taxonomy of viruses，ICTV）的最新定义，人鼻病毒分为 Rhinovirus A、Rhinovirus B 和 Rhinovirus C 3 个种共 169 个基因型，其中 Rhinovirus A 有 80 个基因型，Rhinovirus B有 32 个基因型，Rhinovirus C 有 57 个基因型4。人鼻病毒基因组编码四种结构蛋白（VP1、VP2、VP3和 VP4）和七种非结构蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C和 3D），VP1 是分型的主要参考基因，但 VP2/VP4区也常用于分型5，6。全球不同地区对鼻病毒感染的报告显示，HRVA 和 HRVC 是感染人类的主要型别79。人鼻病毒感染会引起人的上呼吸道疾病，也会导致中耳炎、鼻窦炎和下呼吸道疾病。HRVA和 HRVC 与一些中度和重度疾病有关，而 HRVB主要与一些轻度疾病有关10，11，最新的研究表明，HRVC与哮喘发作有着密切的联系12。本研究收集了 20192021 年广东省 21 个地市SARI 哨点监测医院的全年龄组样本，对人鼻病毒收稿日期：20220818；接受日期：20221101基金项目：广东省自然科学基金（项目号：2019A1515012121），题目：流感病毒在城市轨道交通系统中的传播机理研究；国家自然科学基金（项目号：52178092），题目：耦合飞沫传输与病毒活性的呼吸道传染病传播风险量化研究作者简介：杨康（1996），男，从事病原微生物研究，Email：通讯作者：邹丽容（1975），女，副主任技师，从事病原微生物检验研究，Email：；武婕（1975），女，主任技师，从事病原微生物研究，Email：开放科学（OSID）2期杨康，等.20192021年广东省严重急性呼吸道感染病例中鼻病毒流行情况及其分子分型研究的流行情况进行监测，检出的鼻病毒样本进行分子流行病学的研究，确定当前占优势的基因型，为呼吸道感染疾病防控提供监测数据。材料与方法1 样本来源本次研究样本来自广东省 21 个地市的严重急性呼吸道感染病例（SARI）监测病例，每个地市选择两家哨点医院，每周收集哨点医院的 5个 SARI病例样本，20192021 年间共收集样本 11 543 份，各地市采集样本后经冷链运输至本中心进行统一整理。本研究采用系统抽样的方法抽取了 1 959 份 SARI 病例的咽拭子标本，以保证抽取样本的代表性。SARI病例的定义按照 2009 年中国疾病预防控制中心给出的标准：发热（腋下体温38），伴有咳嗽或咽痛，并出现以下呼吸道疾病症状或体征之一，1）呼吸急促；2）血氧饱和度90%；3）听诊异常。本研究使用样本均来自国家 SARI 监测病例，已通过广东省疾病预防控制中心医学科研伦理审查委员会伦理审查报告和免知情同意申请，伦理评审编号：W96027E202212。2 核酸提取病毒样本振荡混匀静置后用于核酸提取，采用全自动核酸提取仪（上海伯杰医疗科技有限公司，BGAbot96）及配套的核酸提取及纯化试剂盒（上海伯杰医疗科技有限公司，TQBC00196D96）对咽拭子样本进行核酸提取。3 核酸检测运 用 LuminexMAGPIX 检 测 系 统 和 NxTAG Respiratory Pathogen Panel+SARSCoV2 试剂盒对提取好的核酸进行呼吸道多病原检测，检测的病毒包括：人呼吸道合胞病毒 A 型和 B 型（HRSVAB）、副流感病毒（PIV/14）、人鼻病毒（HRV）、人偏肺病毒（HMPV）、腺病毒（ADV）、人博卡病毒（HBoV）、肠道病毒（EV）、冠状病毒 229E（229E）、冠状病毒 NL63（NL63）、冠状病毒 OC43（OC43）、冠状病毒 HKU1（HKU1）、新型冠状病毒（SARSCoV2）ORF1ab 和 M 基因。由于该试剂盒无法区分鼻病毒和肠道病毒，因此将两者合并为人鼻病毒/肠道病毒（HRV/EV）进行统计。4 鼻病毒 VP2/VP4区序列扩增和测序对呼吸道多病原检测鼻病毒阳性的样本使用Invitrogen 公司的一步法反转录聚合酶链式反应试剂盒（SuperScriptTM OneStep RTPCR System with PlatinumTM Taq DNA Polymerase）针对 VP2/VP4 区域进行巢式 PCR 扩增，第一轮扩增引物为1F：CCGGCCCCTGAATGYGGCTAA，1R：ACATRTTYTSNCCAAANAYDCCCAT，反应条件：50 30min，94 2min，94 20s，50 20s，72 45s，35个循环，72 延伸 10min，4保存；第二轮扩增引物为 2F：ACCRACTACTTTGGGTGTCCGTG，2R：TCWGGHARYTTCCAMCACCANCC，反应条件：94 2min，94 15s，55 15s，68 15s，35 个循环，4保存13。PCR 产物使用高效能毛细管 电 泳 分 析 系 统（QIAGEN 公 司，QIAxcel Advanced）检查扩增情况，将凝胶电泳结果显示在目标条带位置（约 520bp）出现清晰条带的 PCR 产物送去昊天生物公司进行 Sanger测序。5 生物信息学分析使用 Editseq 软件对成功测序的序列进行拼接和 整 理。使 用 MEGA11 进 行 序 列 的 比 对 并 在GenBank 数据库下载不同型别 VP2/VP4 区的参考序列，选用参考株的 GenBank 号如下：Rhinovirus A型 为 FJ445117、FJ445111、DQ473503、FJ445119、DQ473501、FJ445114、EF173418、M16248、FJ445175；Rhinovirus C 型为 EU840952、KJ675506、KF958311、GQ223227；Rhinovirus B型为DQ473485。采用邻接法（NeighborJoining，NJ）建立基于 VP2/VP4区的系统进化树，bootstrap值选择为 1 000次。6 统计学分析使用 Excel 对病例的基本信息进行整理，使用SPSS 26.0 软件进行统计学分析，采用 2检验对鼻病毒阳性率进行分析，采用 CochranArmitage 趋势检验分析鼻病毒阳性率随年龄变化的情况，检验水准=0.05。结果1 基本信息共 收 集 1 959 例 严 重 急 性 呼 吸 道 感 染 病 例（SARI），其中男性为 1 205 例，女性为 754 例。年龄 在 1100 岁 之 间，平 均 年 龄 35 岁，依 据 医 学年 龄 阶 段 划 分，处 于 婴 幼 儿 期（60岁）575 例（表 1）。男 性 病 例 中 鼻 病 毒 阳 性 检 出 365病 毒 学 报39卷率为 10.78%，女性病例中鼻 病 毒 阳 性 检 出 率 为9.68%，男 女 之 间 的 阳 性 检 出 率 差 异 无 统 计 学意 义（P0.05）。不 同 年 龄 组 的 鼻 病 毒 阳 性 检出 率 分 别 是 婴 幼 儿 期 15.37%、学 龄 前 期14.61%、青 少 年 期 11.85%、成 人 7.40%、老 年 人6.08%，CochranArmitage 趋 势 检 验 结 果 显 示 不同年龄组之间的鼻病毒阳性检出率差异有统计学 意 义（P0.05）。婴 幼 儿 组 阳 性 检 出 率 最 高，随 着 年 龄 的 增 长，鼻 病 毒 的 阳 性 检 出 率 会下降。2 鼻病毒的不同时间的分布情况20192021 年 的 鼻 病 毒 阳 性 率 分 别 为 6.33%（30/474）、11.66%（102/875）和 11.64%（71/610），不同年份间的鼻病毒阳性率差异有统计学意义（2=10.951，P=0.004），且 2020年和 2021年的鼻病毒阳性率要高于 2019 年的鼻病毒阳性率。20192021年不同月份鼻病毒阳性率的变化趋势如图 1 所示，2019年各月份的鼻病毒阳性率变化不大，2020年鼻病毒阳性率仅在 6 月份有一个高峰期，2021 年鼻病毒阳性率在 4月份和 10月份有两个高峰期。3 鼻病毒混合检出情况在 203 份鼻病毒阳性病例中，有 25 例检出了至少一种其他病毒，混合检出率为 12.31%。合并人副流感病毒（HPIV