5种金边瑞香基因组DNA提取方法比较研究_罗素梅.pdf

种金边瑞香基因组 提取方法比较研究罗素梅，郭崇炎，刘小平，黄冬华，周勇辉，范方喜，赖金莉，张远福（赣州市蔬菜花卉研究所，江西赣州；赣州市蔬菜花卉种质资源开发与利用重点实验室，江西赣州；江西省农业科学院蔬菜花卉研究所，江西南昌）摘要 目的研究不同提取方法对金边瑞香基因组 提取质量的影响，筛选最佳提取方法。方法以金边瑞香叶片为试材，以 法、改良 法、法、高盐低 法和尿素法 种方法提取基因组，并从 纯度、浓度、酶切电泳结果和 扩增产物电泳等方面进行比较分析。结果高盐低 法和尿素法提取的金边瑞香基因组 富含蛋白质和多糖等杂质，纯度低；法提取的基因组 含有一些酚类物质和盐等杂质，纯度较低；改良 法提取的基因组 纯度较高，但浓度和产率低。法提取的基因组 纯度、浓度和产率最高，酶切和 产物电泳检测效果最好。结论 法提取的金边瑞香基因组 质量与产量最佳，可以满足后续分子生物学研究的需求。关键词 金边瑞香；基因组；提取方法中图分类号 文献标识码 文章编号（）：开放科学（资源服务）标识码（）：，（，；，），；基金项目 江西省现代农业产业技术体系建设专项资金资助项目（）；赣州市科技计划项目“金边瑞香产业升级”（赣市科发字 号）。作者简介 罗素梅（），女，江西赣州人，高级农艺师，硕士，从事观赏园艺植物栽培及育种研究。通信作者，研究员，从事园艺作物研究。收稿日期 金边瑞香（）是瑞香科瑞香属瑞香的一个变种，为多年生常绿灌木花卉，是我国传统名花之一，其叶片边缘金黄，花色淡紫，花香浓烈独特，深受广大人民喜爱。金边瑞香富含黄酮类、香豆素类和黏多糖等生理活性物质，具有抑菌、镇痛、抗氧化和调节免疫等功效，是一味珍贵的中药材。金边瑞香是我国特有的种质资源，为江西省赣州市的地方特色花卉，在赣南大部分区县均有栽培，畅销国内外市场且已形成产业化规模，。目前，国内外对金边瑞香的研究主要集中于栽培管理、组培繁育、生物化学性质和医药应用等方面，而关于其分子生物学方面的研究较少。随着现代生物技术的高速发展，植物分子遗传分析等技术也必将运用到金边瑞香的种质资源保护、功能基因挖掘和品种改良等方面，而获得高质量的基因组 是开展金边瑞香分子生物学研究的基本前提。对于一种植物采用不同的基因组 提取方法，其纯度和产量可能会产生很大差异，而所提取的植物基因组 质量是影响后续、酶切等分子试验的重要限制因素之一，因此针对不同种类植物建立相应的 分离纯化方法以获取高质量的基因组 显得至关重要。笔者采用 法、改良 法、法、高盐低 法和尿素法 种方法对金边瑞香基因组 提取效果进行比较研究，以摸索出适宜该植物的 提取纯化方法，为金边瑞香后续相关分子生物学研究提供有益参考和指导。材料与方法 试验材料 金边瑞香植株取样于江西省赣州市大余县，种植于赣州市蔬菜花卉研究所试验大棚。试验仪器与试剂 移液器（赛默飞世尔）、恒温水浴锅（力辰科技）、离心机（赛默飞世尔）、超微量紫外分光光度计（上海嘉鹏）、凝胶成像仪（德国耶拿）、仪（赛默飞世尔）、水平电泳仪（伯乐）。试验所用试剂中限制性内切酶、和 酶均为北京全式金生物技术股份有限公司产品，其余均为国产分析纯试剂。提取方法 改良 法。参考余志雄等的方法，并加以改进。取金边瑞香叶片 ，加入 ，用液氮研磨成细粉后转入 无菌 管中。立即加入 预热的提取缓冲液（、二乙基二硫代氨基甲酸）并加入 巯基乙醇，漩涡混匀 ，水浴 安徽农业科学，（）：，。加入 乙酸钾溶液（），混匀，冰水浴 。离心 ，吸取上清液。向上清液中加入等体积氯仿 异戊醇（体积比 ），漩涡混匀。离心 ，吸取上清液。向上清液中加入等体积 预冷异丙醇，轻柔颠倒混匀 次后 静置。离心 ，弃上清液，保留 沉淀。用 乙醇重复洗涤、沉淀 次。吹干 沉淀，加入 溶液溶解，置于 保存备用。法。参考杨春霞等的方法，并加以改进。取 金边瑞香叶片加入液氮研磨成粉末后装入 离心管中，加入 提取缓冲液（、）和 巯基乙醇，混匀，水浴 。再加入 乙 酸 钾 溶 液（），混 匀，冰 水 浴 。离心 ，取上清液。向上清液中加入等体积氯仿 异戊醇（体积比 ），混匀。离心，取上清液。向上清液中加入等体积 预冷异丙醇，轻柔混匀，静置。离心，弃上清液，保留 沉淀。加入 乙醇，混匀漂洗 沉淀。离心 ，弃上清液，保留 沉淀。用 乙醇重复洗涤、沉淀 次。吹干 沉淀，加入 溶液溶解，保存备用。法。参考孙鑫等的方法，并加以改进。取金边瑞香叶片 加入液氮研磨成粉末后立即加入 粉末，装入 离心管中，立即加入 提取缓冲液（、，）和 巯基乙醇，混匀，水浴 。加入 体积 乙酸钾溶液（），混匀，冰水浴 。离心 ，取上清液，加入 体积 （、，），混匀，水浴 。加入等体积氯仿异戊醇（体积比），混匀。离心 ，取上清液。加入等体积 预冷异丙醇，混匀，静置 。离心，弃上清液，保留 沉淀。用 乙醇重复洗涤，沉淀 次。吹干 沉淀，加入 溶液溶解，放 保存备用。高盐低 法。参考邵亚林等的方法，并加以改进。取 金边瑞香叶片，用液氮研磨成细粉后加入 离心管 中。立 即 加 入 预 热 的 提 取 缓 冲 液（乙酸钠溶液、，）和 巯基乙醇，漩涡混匀，水浴。离心，取上清液。向上清液中加入 乙酸钾溶液（），混匀，冰水浴 。离心 ，取上清液。向上清液中加入等体积氯仿 异戊醇（体积比 ），混匀。离心 ，取上清液。向上清液中加入等体积的 预冷异丙醇，轻柔颠倒混匀 次后 静置。离心 ，弃上清液，保留 沉淀。加 入 乙 醇，混 匀 漂 洗 沉 淀。离心 ，弃上清液，保留 沉淀。用 乙醇重复洗涤、沉淀 次。吹干 沉淀，加入 溶液溶解，保存备用。尿素法。参考白雪嵩等的方法，加以改进。取金边瑞香叶片 加入液氮研磨成粉末，装入 离心管中，立即加入 提取缓冲液（尿素、，）和 巯基乙醇，混匀，水浴 。加入 乙酸钾溶液（），混匀，冰水浴。异戊醇（体积比 ），混匀。离心，取上清液。加入等体积 预冷异丙醇，轻柔混匀多次，静置 。离心 ，弃上清液，保留 沉淀。加入 乙醇，混匀漂洗 沉淀；离心 ，弃上清液，保留 沉淀。用 乙醇重复洗涤、沉淀 次。吹干 沉淀，加入 溶液溶解，保存备用。质量检测 浓度测定。超微量紫外分光光度计检测 种方法所提取基因组 的 值、值和 浓度。采用 软件分析各处理间显著性（标记字母法，）。琼脂糖凝胶电泳。分别吸取不同方法提取的 样品 与 混匀，在 琼脂糖凝胶上点样，在 缓冲液中 恒压电泳 后，在凝胶成像系统上观察、拍照。酶切验证。对 种不同方法提取的 分别采用、双酶切，酶切反应体系为：（）、。反应物轻柔混匀，水浴反应 。琼脂糖凝胶点样，电泳检测，凝胶成像仪拍照记录。检测。采用 引物（引物序列：）对 种方法提取 进行 扩增，反应体系按照 （）说明书配制。反应程序为：预变性 ；变性 ；复性 ；延伸 ；循环 次，延伸 ；保存。在 琼脂糖凝胶上点样、电泳检测，凝胶成像仪上拍照记录。结果与分析 浓度检测 由表 可知，法、改良 法和 法提取的金边瑞香基因组 值分别为、和，都在，且三者无显著性差异，表明这 种方法对 和蛋白质等大分子杂质去除比较干净，纯度较高；高盐低 法和尿素法提取的 值分别为 和，都小于，表明蛋白质、等大分子没有去除干净，降低了 纯度。法、改良 法和 法提取的 值大于.，卷 期 罗素梅等 种金边瑞香基因组 提取方法比较研究且 法的 值最高，而高盐低 法和尿素法提取的 均小于，说明 法、改良 法和 法去除小分子、酚类物质和盐等杂质的能力比高盐低 法和尿素法更强。根据 浓度和产率结果可知，法所提 浓度与产率最高，法次之，然后为尿素法，改良 法和高盐低 法所得到的数值相近且很低。表 种方法提取金边瑞香基因组 结果 序号方法 浓度 产率 法 改良 法 法 高盐低 法 尿素法 注：同列小写字母表示处理间差异显著（）。：（）琼脂糖凝胶电泳检测 对 种方法提取的金边瑞香基因组 进行琼脂糖凝胶电泳检测（图），结果发现，改良 法和 法提取的 点样孔内无显著荧光出现，表明这 种方法已经将大多数蛋白质、糖类和 等杂质去除，获得了较纯的；但改良 法提取的 样本亮度低，这说明该方法提取的基因组 浓度低。法、高盐低 法和尿素法提取的 点样孔中有较显著的荧光，而 法和尿素法存在拖尾现象，说明这 种方法去除蛋白质、糖类和 等杂质能力较差。这与表 中的结果一致。注：法；高盐低 法；法；改良 法；尿素法。：；图 种方法提取的基因组 琼脂糖凝胶电泳 酶切结果分析 对这 种方法提取的金边瑞香基因组 分别进行酶切验证（图），结果发现，法提取的金边瑞香基因组 酶切电泳后呈弥散状，条带形成清晰完整的连续拖带，条带最宽，且点样孔中无荧光，表明该方法提取的 杂质含量少，浓度高，质量最好。法提取的 经双酶切电泳后，条带呈弥散状，有完整的连续拖带，点样空内无明显荧光，但条带宽度小于 法所提，说明 法提取的金边瑞香 质量次之。尿素法提取的 酶切电泳后呈弥散状，有完整的连续拖带，点样空内少量荧光，但条带宽度较小，表明尿素法提取的 纯度不高。改良 法提取的 酶切电泳后呈弥散状，有完整的连续拖带，但条带亮度暗，表明所提取的 浓度低。高盐低 法提取的 酶切电泳后没有完整的连续拖带，条带窄且亮度暗，表明该方法提取的 质量最差。注：法；高盐低 法；法；改良 法；尿素法。：；图 种方法提取的基因组 酶切 检测 以 种不同方法提取的金边瑞香基因组 为模板，采用 引物进行 扩增后电泳检测（图）。结果表明，种方法提取的 经 扩增、电泳后分别在 、和 处产生 个条带，但不同方法所提取 的 产物电泳后条带 安徽农业科学 年亮度存在一定差异。法相对另外 种方法的 个条带均为最亮，法次之，改良 法和尿素法条带亮度均较淡且相近，高盐低 法条带亮度最暗。注：法；高盐低 法；法；改良 法；尿素法。：；图 种不同提取方法 扩增结果 结论与讨论该试验采用的 种方法均能提取出金边瑞香基因组，但不同方法的提取质量存在差别。种方法中 法、改良 法和 法的 值均在，尿素法和高盐低 法 值都小于，表明前 种方法对蛋白质和 等大分子去除较干净，纯度较高，后 种方法所提 则仍含有大分子杂质。种方法中 法、改良 法和 法的 值都大于，表明这 种方法去除小分子、酚类物质和盐等杂质的效果更好。浓度和产率结果表明，法所达到的水平最高，高盐低 法最低。对不同方法所提 进一步进行琼脂糖凝胶电泳检测后也得出了一致的结果。种方法提取的金边瑞香基因组 经过双酶切后均能产生酶切条带、检测也都能扩增出条带，但不同方法的酶切和 电泳检测条带存在差异，其中，以 法酶切效果及 电泳结果最佳，这表明 种方法提取的 虽然都可以进行分子生物学相关试验，但提取质量存在差异。综上分析表明，不同方法提取金边瑞香基因组 质量表现为 法 法尿素法改良 法高盐低 法。获得高纯度、高浓度的基因组 是进行观赏植物功能基因研究、分子标记辅助育种和遗传多样性分析等分子生物学研究的基础保障。影响植物 高效提取的因素有很多，主要包括多糖、色素、酚类物质和蛋白质等杂质，尤其是金边瑞香的根、茎、叶等组织中都富含多糖、酚类和黄酮类等次生代谢产物，因此提取纯化植物基因组 的关键在于高效地除去这些物质。该试验中 法提取的金边瑞香基因组 浓度最高、纯度最好，完全可用于后续相关分子生物学研究。与孙鑫等的方法相比，该研究采用 法直接将 与植物样本粉末快速混匀，使 立即充分地络合干扰 纯度的多酚类物质，防止 氧化褐变。在提取缓冲液中适当提高巯基乙醇用量，以防止 断裂并更有效地破坏蛋白质的肽链，从而降解植物蛋白质及抑制细胞中多种酶活性。提取缓冲液中高浓度的 有利于多糖去除，而提取液中依次加入高浓度乙酸钾溶液、可以更有效地除去多糖。多次去除多糖，有助于高质量 的获得。氯仿 异戊醇抽提可以进一步去除样本中的脂类、蛋白质等杂质，从而提高 纯度与产率。该试验对金边瑞香基因组 的提取方法进行了比较研究，发现 法、改良 法、法、高盐低 法和尿素法对金边瑞香样本中多糖、酚类和蛋白质等杂质均可以不同程度地去除而分离获得，但 法提取的 质量与产率最佳，各项指标都优于其他 种方法。金边瑞香基因组