2-乙酰基-4-四羟基-丁...成年雌性大鼠的免疫毒性研究_袁悦.pdf

0 8 1CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS论著癌变畸变突变2023 年 3 月第 35 卷第 2 期收稿日期：2023-01-31；修订日期：2023-03-13基金项目：国家自然科学基金(82073586)作者信息：袁悦，E-mail：。*通信作者，郝卫东，E-mail：2-乙酰基-4-四羟基-丁基咪唑对成年雌性大鼠的免疫毒性研究袁悦，原黎兰，赵喆，肖倩倩，魏雪涛，郝卫东*(北京大学公共卫生学院毒理学系/食品安全毒理学研究与评价北京市重点实验室，北京100191)Immunotoxicity of2-acetyl-4-tetrahydroxybutylimidazole on adult female ratsYUAN Yue,YUAN Lilan,ZHAO Zhe,XIAO Qianqian,WEI Xuetao,HAO Weidong*(Department of Toxicology,School of Public Health,Peking University/Beijing Key Laboratory of Toxicological Research and RiskAssessment for Food Safety,Beijing 100191,China)【摘要】目的：探究类焦糖色制作过程中的主要副产物2-乙酰基-4-四羟基-丁基咪唑(THI)对雌性大鼠免疫系统的影响。方法：选取50只健康成年的SPF级雌性SD大鼠，随机分为5组，每组10只，进行THI经口灌胃染毒，剂量分别为0、0.1、0.5、2.5和5mg/kg，连续染毒30 d。记录大鼠体质量并测定胸腺和脾脏的脏器系数，取大鼠胸腺进行组织病理学观察，用全自动血细胞分析仪检测外周血中白细胞及各分类细胞的数量，通过淋巴细胞转化试验测定脾脏T淋巴细胞的增殖能力，用乳酸脱氢酶法测定脾脏NK细胞的活性，利用流式细胞术分析外周血、胸腺和脾脏中主要免疫细胞的比例变化。结果：THI染毒可使大鼠胸腺皮质/髓质面积比下降。与对照组相比，2.5和5 mg/kg的THI染毒能降低大鼠脾脏T淋巴细胞的增殖能力(P0.01)。流式细胞术检测结果显示，与对照组相比，2.5 mg/kg及以上剂量THI染毒能降低大鼠外周血中白细胞总数和T淋巴细胞的比例(P0.01)，0.5 mg/kg及以上剂量组大鼠外周血中淋巴细胞数和B淋巴细胞的比例显著降低(P0.05或P0.01)，5 mg/kg的THI染毒可使脾脏中T细胞的比例下降(P0.01)、NK细胞的比例升高(P0.01)。T细胞亚群的分析结果显示，5 mg/kg的THI能降低大鼠外周血中Th细胞的比例(P0.01)，0.5 mg/kg及以上剂量THI可使胸腺中Th细胞的比例升高(P0.05或P0.01)、CD4+CD8+双阳性T细胞的比例下降(P0.05或P0.01)，2.5 mg/kg及以上剂量THI可升高胸腺中CTL细胞的比例(P0.01)。结论：THI经口暴露可损伤雌性大鼠的免疫系统，外周血中淋巴细胞数目减少是其敏感的效应指标，本研究条件下THI免疫毒性的未观察到有害作用水平(NOAEL)为0.1 mg/kg。【关键词】2-乙酰基-4-四羟基-丁基咪唑；大鼠；免疫毒性；淋巴细胞减少症中图分类号：R994.4文献标志码：A文章编号：1004-616X(2023)02-0081-06doi：10.3969/j.issn.1004-616x.2023.02.001【ABSTRACT】OBJECTIVE：To investigate immunotoxicity of the main by-product 2-acetyl-4-tetrahydroxy-butylimidazole(THI)，in the process of class caramel color production，on female rats.METHODS：50healthy adult female SD rats with SPF grade were randomly divided into 5 groups，10 rats in each group.They were given THI orally at doses of 0，0.1，0.5，2.5 and 5 mg/kg，respectively，continuously for 30 days.The followings were collected/evaluated：body weights，organ coefficients of thymus and spleen，histopathologicalevaluationofthymuses，numberofwhitebloodcellsandvarioustypesofcellsinperipheralblood，proliferation ability of spleen T lymphocytes，activities of NK cells，and flow cytometry evaluation of changesin the proportion of major immune cells in peripheral blood，thymus and spleen.RESULTS：THI exposurereduced the area ratio of thymus cortex/medulum and the proliferation ability of rat spleen T lymphocytes(with2.5 and 5 mg/kg doses).The results of immunocytopathology showed that THI exposure at a dose of 2.5 mg/kgand above reduced the ratio of the total number of white blood cells and T lymphocytes in the peripheralblood and increase the ratio of NK cells in the spleen.The number of lymphocytes and the ratio of Blymphocytes in the peripheral blood were significantly reduced，and the ratio of T cells in the spleen was alsoreduced by the 5 mg/kg THI exposure.For the T cell subsets，5 mg/kg THI exposure reduced the ratio of Thcells in the peripheral blood.With doses of 0.5 mg/kg and above，THI increased the ratio of Th cells in the论著癌变畸变突变0 8 2CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESISVol.35No.2Mar.2023thymus and CD4+CD8+double positive.The proportions of non-positive T cells were reduced.With doses of 2.5mg/kg and above，THI increased the proportion of CTL cells in the thymus.CONCLUSION：Oral exposuretoTHIcauseddamagetotheimmunesystemoffemalerats.Inaddition，changesinthenumberoflymphocytes in peripheral blood and the proportion of thymus T cell subsets were sensitive indicators.Thus，the no observed adverse effect level of THI immunotoxicity(NOAEL)is 0.1 mg/kg.【KEY WORDS】2-acetyl-4-tetrahydroxybutyl imidazole；rat；immunotoxicity；lymphopenia焦糖色(caramel)是碳水化合物在受控的加热(焦糖化)和化学加工条件下制成的复杂混合物1，广泛应用于饮料、酒类、烘焙品、酱及酱制品、调味品等各种食品类别中2。焦糖色根据其生产过程中所使用的反应物的不同可分为4类：普通法焦糖色(类)、苛性亚硫酸盐法焦糖色(类)、氨法焦糖色(类)和亚硫酸铵法焦糖色(类)3。低分子量化合物2-乙酰基-4-四羟基-丁基咪唑(2-acetyl-4-tetrahydroxybutyl imidazole，THI)是类焦糖色在制备过程中形成的主要副产物之一4。既往的研究表明，长期摄入类焦糖色会导致大鼠出现淋巴细胞减少症5，随后Kroeplien等6从III类焦糖色中分离鉴定出THI，并确定这一症状是由THI引起的。此后的多项研究均表明，THI在一定剂量下可引起大小鼠血液中白细胞及T、B淋巴细胞数目减少，并与膳食中维生素B6的含量有关7-9。除淋巴细胞减少外，THI 还可影响动物免疫系统的整体功能。Houben等10的研究发现，THI能抑制大鼠脾脏NK细胞的活性，损害机体对 T 细胞依赖抗原的抗体反应。Gobin和Phillips11的研究也表明，THI能降低大鼠T、B淋巴细胞的增殖能力，抑制迟发型超敏反应。因此，THI具有一定的免疫抑制作用，特别是能够引起外周血淋巴细胞数目减少，影响免疫系统功能。但既往有关THI免疫毒性的研究基本都在20世纪进行，毒性资料较为陈旧，且大多为单一剂量研究，剂量-效应关系不够明确，尚不能针对敏感的免疫终点效应获得稳定可靠的未观察到有害作用水平(noobserved adverse effect level，NOAEL)，不能满足风险评估的需求。本研究将全面探究THI暴露对大鼠免疫系统的影响，包括对免疫功能和免疫细胞变化的研究，旨为THI健康指导值的制定提供依据。1材料与方法1.1实验动物SPF级雌性SD大鼠，体质量180220 g，购自北京市维通利华实验动物技术有限公司。动物饲养于屏障环境，温度为2025，相对湿度为40%70%，维持12 h/12 h明暗交替循环，自由饮水和进食。饲料为参照实验动物配合饲料营养成分(GB 14924.3-2010)中维生素指标要求，配制而成的维生素B6含量为6 mg/kg的维持饲料。动物实验符合北京大学动物福利和管理委员会的相关规定(批准文号LA2020088)。1.2主要试剂与仪器THI，纯度大于 99.99%，购自日本 Wako 公司；RPMI-1640培养基购自美国Hyclone公司；刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)购自美国Sigma公司；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)购自美国Amresco 公司；流式抗体 Anti-rat-CD3 FITC、Anti-rat-CD4 PerCP/Cyanine5.5、Anti-rat-CD8 PE/Cyanine7、Anti-rat-CD161 PE 购自美国 BioLegend 公司；Anti-rat-CD45RA BV421购自美国BD公司。全自动血细胞分析仪为美国IDEXX公司ProCyteDx型；二氧化碳培养箱为美国Thermo公司3111型；流式细胞仪为美国Beckman Coulter公司Galli