2023年外周血循环肿瘤DNA在结直肠癌中应用价值的探索研究.doc

论文独创性声明 83 英文缩略词注释 缩略词 英文全称 中文全称 CRC colorectal cancer 结直肠癌 CEA carcinoembryonic antigen 癌胚抗原 ctDNA circulating tumor DNA 循环肿瘤核酸 cfNA cell free nucleic acid 无细胞的核酸 cfDNA circulating free DNA 循环游离核酸 PCR polymerase chain reaction 聚合酶链式反响 RT-PCR reverse transcription PCR 逆转录PCR dPCR digital PCR 数字PCR ARMS amplification refractory mutation system 突变扩增阻滞系统 BEAMing beads，emulsions，amplification and magnetics 流式技术的磁珠乳液扩增方法 ddPCR droplet digital PCR 数字液滴PCR NGS next generation sequencing 第二代测序技术 TAM-Seq tagged-amplicon deep sequending 标记扩增深度测序技术 CAPP-Seq cancer personalized profiling by deep sequencing 肿瘤个体化分析深度测序法 EGFR epidermal growth factor receptor 表皮生长因子受体 KRAS kirsten rat sarcoma viral oncogene 鼠类肉瘤病毒癌基因 NCCN National Comprehensive Cancer Network 美国国立综合癌症网络 mCRC metastatic colorectal cancer 转移性结直肠癌 NRAS Neuroblastoma RAS viral oncogene homolog 神经母细胞瘤RAS病毒癌基因同源物 BRAF v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1 鼠类肉瘤病毒癌基因同源物B1 PIK3CA Phosphotylinosital 3 kinase 磷酸肌醇3激酶 AJCC American Joint Committee On Cancer 美国抗癌联合会 TNM tumor；node；metastasis 肿瘤分期模型 qPCR quantitative real-time PCR 实时定量PCR MRD minimal residual disease 最小残留病灶 RFS relapse free survival 无复发生存期 CTC circulating tumor cells 循环肿瘤细胞 EMT epithelial-mesenchymal transition 上皮间质转变 EpCAM epithelial cell adhesion molecule 上皮细胞黏附分子 FDA food and drug Administration 食品药品监督管理局 PFS progression-free survival 无进展生存期 OS overall survival 总生存期 DFS disease-free survival 无病生存期 PET-CT positron emission tomography-computed tomography 正电子发射计算机断层显像 LARC local advanced rectal cancer 局部进展期直肠癌 中文 研究目的： 结直肠癌〔colorectal cancer，CRC〕早期、精准诊疗是临床面临的新挑战。传统上，肿瘤诊断是以组织标本提供的病理学为金标准，但在获取组织活检时存在有创操作的风险、无法获取肿瘤组织的困难。而以循环肿瘤DNA〔circulating tumor DNA，ctDNA〕为代表的液体活检给临床诊治带来了新的希望。ctDNA的检测具有易获取、可重复采集、相对无创、敏感度及特异度较高的优点。目前主要的检测途径分为两大类，一类为基于PCR的途径，另一类是基于基因测序的途径。本研究我们通过使用基于PCR和基因测序的ctDNA检测技术，寻找CRC患者外周血ctDNA中KRAS突变规律与临床病理特征的相关性，以及与肿瘤组织中KRAS突变的一致性。进一步了解CRC伴肝转移患者ctDNA基因表达情况及其临床意义。 研究方法： 1. 用基于qPCR的super-ARMS方法对95例AJCC分期为I-IV期的CRC患者ctDNA进行检测，评价组织突变、外周血ctDNA突变与临床病理特征之间的相关性，并通过评价组织中与ctDNA中KARS基因突变的一致性，来探索ctDNA在CRC患者中的应用价值。 2. 通过基于二代测序的方法，对20例结直肠癌伴肝转移的患者的组织标本，术前术后的ctDNA进行检测和分析，探讨组织和ctDNA基因突变的表达情况和相关的临床意义。 研究结果： 1. 组织KRAS基因突变与临床特征如年龄、性别、肿瘤家族史、是否吸烟、部位、血清CEA、TNM分期等因素无明显相关性。 2. 血浆ctDNA的KRAS基因突变和M分期相关〔〕，说明有远处转移患者突变率更高。 3. ctDNA与组织的KRAS一致性检验提示两者的总体；进一步亚组分析中可以看到，年龄<60岁组、有肿瘤家族史、有淋巴结转移和远处转移、神经侵犯、脉管浸润、中高分化人群中kappa更高〔〕。M分期〔，95%CI：〕为影响ctDNA与组织KRAS突变一致性的独立预测指标。 4. 通过 ctDNA检测KRAS突变的敏感度为33.33%，特异度为98.11%，阳性预测值93.33%，阴性预测值65%。 5. 组织DNA测序结果中突变率较多基因位点是TP53〔15/20，70%〕，其次是KRAS〔11/20，55%〕，APC〔10/20，50%〕，PIK3CA〔4/20，20%〕。术前ctDNA突变率较多基因位点是TP53〔13/20，65%〕，其次是KRAS〔10/20，50%〕，APC〔10/20，50%〕，PIK3CA〔3/20，15%〕，ERBB2〔2/20，10%〕。术后血仅4例检测到不同程度的基因突变。 6. 术前ctDNA与组织检测基因突变结果高度符合，一致性〔完全匹配和局部匹配〕达85%。对于突变频率最高的TP53、APC、KRAS和PIK3CA基因，86.7%、90.9%、100%和75%的病例为组织、术前血均突变阳性。 7. 术后外周血cfDNA总量明显高于术前总量，cfDNA总量前后变化具有统计学意义〔〕。对外周血ctDNA含量分析发现，术前外周血ctDNA含量明显高于术后含量，ctDNA含量前后变化具有统计学意义〔〕。术前外周血突变阳性和阴性组中cfDNA总量、ctDNA含量无明显差异〔，〕。术后外周血突变阳性组中ctDNA含量明显比阴性组高〔〕。 8. 对16例有效随访病例〔随访时间>6个月〕进行分析发现，术前和术后ctDNA突变状态与患者影像学复发无明显相关性。进一步比拟cfDNA和ctDNA含量提示，术后复发与无复发患者其含量在术前、术后检测均无统计学差异。 研究结论： 1. 在CRC患者中应用super-ARMS法检测ctDNA是简便、可行的。ctDNA检测突变具有相对较高的特异度和阳性预测值。在年龄<60岁组，分期相对较晚的亚群中，原发肿瘤组织和ctDNA中KRAS基因突变的一致性尚可接受。对于晚期CRC患者，在选择抗EGFR靶向药物治疗前， ctDNA的检测可用于对KRAS基因突变情况进行初筛，防止不必要的治疗。 2. 基于二代测序的ctDNA的分子检测与组织基因检测突变的一致性较高，在检测治疗反响和耐药性方面，具有替代肿瘤组织基因检测的潜在效用。特别是对于无法取活检的肿瘤患者〔如转移性癌症患者〕，或者当组织学样本的质量太差无法用于分子检测时。 3. 术前、后ctDNA突变状态和ctDNA、cfDNA含量与患者影像学复发无统计学相关性。但术前血、组织与术后血突变状态一致性可能与术后是否出现肿瘤复发的风险有关，其识别复发敏感性可能早于肿瘤指标的动态演变。 关键词： 结直肠癌，循环肿瘤DNA，循环游离DNA，二代测序 Abstract Objectives: Colorectal cancer (CRC) is the most common malignancy in the digestive system and seriously jeopardizes public health. Early and accurate diagnosis and treatment of CRC are new clinical challenges. Traditionally, tumor diagnosis is based on the pathological criteria provided by tissue specimens, but there is a risk of invasive procedures in obtaining tissue biopsy and difficulties in obtaining tumor tissue. The liquid biopsy represented by circulating tumor DNA (ctDNA) brings new hope to clinical diagnosis and treatment. The detection of ctDNA has the advantages of easy access, reproducible acquisition, relative non-invasiveness, and high sensitivity and specificity. At present, the main detection methods are divided into two types, one is a PCR-based method, and the other is a method based on gene sequencing. In this study, we used PCR-based and gene-sequencing ctDNA detection techniques to look for correlations between KRAS mutations and clinical pathological features in peripheral blood ctDNA of patients with CRC, as well as consistency with KRAS mutations in tumor tissues. Furthermore, we attempeted to validate the ctDNA mutations in CRC patients with liver metastases and their clinical significance. Methods: 1. The qPCR-based super-ARMS method was used to detect ctDNA in peripheral blood of 95 c