TWEAK_Fn14在结节性红斑患者皮损组织中的表达_罗迈.pdf

基金项目国家自然科学基金项目(82173445)作者单位 1.西安交通大学第二附属医院科研中心实验室，陕西 西安 710004;2.西安交通大学第二附属医院皮肤科，陕西 西安 710004通信作者夏育民，E-mail:网络首发时间 2022-12-0717 58 网络首发地址https:/ 年 3 月第 37 卷第 3 期Mar.2023，Vol37，No3279http:/TWEAK/Fn14 在结节性红斑患者皮损组织中的表达罗迈1，彭雪婷2，王思佳2，刘玮2，顾汉江2，陆美2，王亚琦2，夏育民2 摘要 目的探讨 TWEAK/Fn14 信号通路在结节性红斑中的表达情况及意义。方法收集西安交通大学第二附属医院皮肤科 2021 年 6 月 2021 年 10 月结节性红斑患者 15 例，取同期正常组织为对照，行石蜡组织包埋术及病理切片，提取组织蛋白和 NA，免疫组织化学染色、实时荧光定量 PC 及蛋白印迹检测 TWEAK 和Fn14 分子在结节性红斑皮损组织和正常组织中的表达，并进行差异比较和统计学分析。结果免疫组织化学检测结果显示，TWEAK/Fn14 蛋白在正常组织中低表达，在患者皮损处显著高表达，尤其在脂肪小叶及血管周围，并伴有多种炎症细胞浸润、脂肪肉芽肿和纤维化;实时荧光定量 PC 及蛋白印迹检测显示患者皮损组织中的 TWEAK/Fn14 信号表达显著高于正常组织对照组(P 0.05)。结论TWEAK/Fn14 信号通路可能在结节性红斑发病机制中发挥重要作用，有望成为治疗结节性红斑的潜在靶点。关键词 结节性红斑;肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子(TWEAK);成纤维细胞生长诱导因子 14(Fn14);信号通路 中图分类号 758.61 文献标志码 A 文章编号 1001 7089(2023)03 0279 05 DOI 10 13735/j cjdv1001-7089 202209003Expression of TWEAK/Fn14 in Skin Lesion of Patients with Erythema NodosumLUO Mai1，PENG Xueting2，WANG Sijia2，LIU Wei2，GU Hanjiang2，LU Mei2，WANG Yaqi2，XIA Yumin2(1.Laboratory Scientific esearch Center，the Second Affiliated Hospital of Xian Jiaotong University，Xian 710004，China;2.Department of Dermatology，the Second Affiliated Hospital of Xian Jiao-tong University，Xian 710004，China)Corresponding author XIA Yumin，E-mail: Abstract ObjectiveTo investigate the expression and significance of TWEAK/Fn14 signalingpathway in erythema nodosum MethodsA total of 15 patients with erythemanodosum treated from the Department of Dermatology of the Second Affiliated Hospitalof Xi an Jiaotong University from June 2021 to October 2021 were enrolled.Thenormal tissues of the same period were taken as control.Tissues were processed withpathological processing for paraffin embedding by slicing into sections.Tissue proteinand NA were extracted，and then the expression of both TWEAK and Fn14 in skinlesion of erythema nodosum and normal tissues were determined by immunohistochemicalstaining，real-time fluorescence quantitative PC and Western blot.Statistical analysishttp:/was performed for the differences esultsImmunohistochemical staining showedthat TWEAK/Fn14 protein was lowly expressed in normal tissues，and significantlyhighly increased in skin lesions，especially in fat lobules and vessels，accompaniedby a variety of inflammatory cell infiltration，fat granulomas and fibrosis.eal-timefluorescence quantitative PC and Western blot analysis demonstrated that theexpression levels of TWEAK and Fn14 in the skin lesions of the patients wassignificantly higher than those of the control group(P 0.05)ConclusionTheTWEAK/Fn14 signaling pathway may play an important role in the pathogenesis oferythema nodosum，and is a potential therapeutic target for patients with erythemanodosum.Key words Erythema nodosum;TWEAK;Fn14;Signaling pathway结节性红斑(erythema nodosum，EN)是一种发生于皮下脂肪间隔的慢性炎症性疾病，好发于年轻女性，皮损多发生于下肢，主要表现为对称分布的鲜红色结节、斑块，自觉疼痛和压痛。结节性红斑可分为特发型和继发型两大类，大多数患者为特发型，病因不明;继发型多与真菌感染、恶性肿瘤、妊娠、口服避孕药相关1。组织病理学表现为皮下脂肪间隔内炎症细胞浸润、脂肪肉芽肿、小叶间隔受累及毛细血管增生。结节性红斑发病机制复杂，目前尚未完全明确2-3。肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子(tumor necro-sis factor-like weak inducer of apoptosis，TWEAK)主要由炎症浸润组织中巨噬细胞等炎症细胞合成分泌，其唯一受体成纤维细胞生长诱导因子 14(fibro-blast growth factor-inducible 14，Fn14)结合 TWEAK后可激活下游信号通路发挥调控作用。TWEAK/Fn14 在生理条件下低表达，但在应激或者组织损伤时表达增加，轻度激活可促进组织再生和修复，过度及持续激活则会引起一系列炎症反应。TWEAK 和受体 Fn14 结合后能诱导角质形成细胞、成纤维细胞、微血管内皮细胞等增殖、迁移和血管形成，并分泌 IL-6、IL-8、调节正常 T 细胞表达和分泌的活性因子(regulated upon activation normal T cell expressedand secreted，ANTES)等促炎因子4。本课题组前期研究提出 Fn14-TAF2-TNF 信号轴观点:特定炎症微环境改变细胞的 TNF(肿瘤坏死因子受体)表达谱，免疫细胞分泌的 TWEAK 与细胞跨膜 Fn14 结合，通过肿瘤坏死因子受体相关因子2(TNF receptorassociated factor 2，TAF2)将信号传导至 TNF 亚型分子，继而调控细胞凋亡(TNF1 高表达)或增殖(TNF2 高表达)5-6。迄今为止，TWEAK/Fn14 信号在结节性红斑中的表达尚无文献报道，因此本研究主要检测 TWEAK/Fn14 在结节性红斑患者组织中的表达水平，研究其在结节性红斑发病过程中的作用，并为其相关药物治疗提供方向。1资料与方法1.1一般资料选取 2021 年 6 月 2021 年 10 月就诊于西安交通大学第二附属医院并于皮肤科完善皮肤活检的结节性红斑患者，其中男 5 例，女 10 例，年龄 23 50 岁。正常对照组来自皮肤科色素痣切除术的患者。入选标准:经临床及皮肤病理确诊的结节性红斑患者，即临床表现为下肢对称分布、伴有触痛的红色皮下结节或红斑，同时病理表现为小叶间隔受累为主的脂膜炎患者，且患者无其他皮肤病及全身系统性疾病。1.2主要试剂与仪器兔抗人 Fn14 多克隆抗体、兔抗人-actin 多克隆抗体(美国 CST 公司)，兔抗人 TWEAK 多克隆抗体(美国 Abcam 公司)，Trizol(invitrogen);逆转录试剂盒、SYB Green(Takara);PC 引物(上海生工生物工程公司);实时荧光定量PC 仪(ABI);蛋白垂直电泳及转膜装置(德国BIO-AD 公司)。1.3方法1.3.1实时荧光定量 PC取上述皮损组织和正常组织采用 Trizol 进行 NA 提取，反转录后获得模板 cDNA，实时荧光定量 PC 检测组织中 TWEAK、Fn14 基因表达水平，TWEAK 正向引物序列为 5-AGGTGTGGACGGGACAGTGAG-3，反向引物序列为5-CCAGCACACCATCCACCAG-3，Fn14 正向引物序列为 5-CTCTGAGCCTGACCTTCGTG-3，反向引物序列为 5-GGGGGCACATTGTCACTGGA-3，GAPDH正向引物序列为 5-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3，反向引物序列为 5-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3。引物合成于上海生工生物工程公司。082中国皮肤性病学杂志 2023 年 3 月第 37 卷第 3 期Chin J Derm Venereol，Mar.2023，Vol.37，No.3罗迈，彭雪婷，王思佳，等 TWEAK/Fn14 在结节性红斑患者皮损组织中的表达http:/1.3.2蛋白印迹IPA 裂解液提取组织总蛋白，BCA 定量法测定蛋白浓度，加入5 loading buffer 制定蛋白样品，95 变性 5 min，蛋白样品等质量等体积上样后进行 SDS-PAGE 电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭 1 h，加入 TWEAK、Fn14、-actin 抗体 4 孵育过夜，洗膜后加入对应种属的二抗室温孵育 1 h，PBST 洗膜 4 次，ECL 化学发光系统成像并进行灰度值统计。1.3.3免疫组织化学染色将切好的石蜡组织载玻片于62 烘烤30 40 min，常规脱蜡、水化，抗原修复 10 min 后自然冷却至室温，PBS 浸洗，组织表面滴加 3%内源性过氧化物酶室温孵育 10 min，PBS浸洗 5 min，2%BSA 封闭，37 孵育 30 min，滴加适当比例的一抗，4 湿盒过夜。次日滴加 DAKO 二抗，DAB 显色，苏木素复染，PBS 返蓝，干燥后中性树胶封片。1.3.4统计学处理采用 SPSS18.0 统计软件对检测数据进行统计学分析。数据以 x s 表示，两组间比较采用独立样本 t 检验;若数据不符合正态分布，则采用 W