Sr+β-TCP+OCP材...干细胞活性及成骨分化的影响_王宁宁.pdf

解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1【摘要】目的探究锶/磷酸三钙/磷酸八钙（Sr+TCP+OCP）材料对大鼠脂肪肪来源干细胞（rADSCs）活性及成骨分化的影响。方法将SD大鼠安乐处死，进行rADSCs原代培养后完成rADSCs成骨诱导，制备 Sr+TCP+OCP、TCP、OCP 材料，随机分为 1%Sr+TCP+OCP 组、3%Sr+TCP+OCP 组、5%Sr+TCP+OCP组、TCP组、OCP组、对照组（成骨诱导培养液）。甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测rADSCs增殖，检测碱性磷酸酶（ALP）活性及钙离子含量，蛋白质免疫印迹（WB）检测rADSCs成骨相关蛋白。结果与对照组和 3%Sr+TCP+OCP 组相比，TCP 组、OCP 组、1%及 5%Sr+TCP+OCP 组第 1 天、3 天、6 天 吸光值（A）均下降（P0.05）。在 d3、d6 5%Sr+TCP+OCP 组 A 值均低于 TCP 组、OCP 组、1%SrTCP 组（P0.05）。随着时间延长，各组 A 值均升高（P0.05）。与对照组、TCP 组、OCP 组相比，1%、3%Sr+TCP+OCP组ALP活性、钙离子含量升高（P0.05），5%Sr+TCP+OCP组ALP活性、钙离子含量降低（P0.05）；3%Sr+TCP+OCP组ALP活性、钙离子含量高于1%、5%Sr+TCP+OCP组（P0.05）；1%Sr+TCP+OCP组ALP活性、钙离子含量高于 5%Sr+TCP+OCP 组（P0.05）。与对照组和 TCP 组、OCP 组相比，3%Sr+TCP+OCP组runt相关转录因子2（Runx2）、增殖细胞核抗原（PCNA）降低，1%、5%Sr+TCP+OCP 组Runx2、PCNA升高（P0.05）；3%Sr+TCP+OCP 组 Runx2、PCNA 低于 1%、5%Sr+TCP+OCP 组（P0.05）；1%Sr+TCP+OCP组Runx2、PCNA低于5%Sr+TCP+OCP 组（P0.05）。结论3%Sr+TCP+OCP 材料能提高rADSCs 生物学活性以及成骨分化能力，可能与调整Runx2/PCNA信号通路有关。【关键词】锶/磷酸三钙/磷酸八钙；脂肪干细胞；成骨分化；增殖细胞核抗原基金项目：基金项目：2019 年度学校科研课题攻关项目、第二批校级科研课题及博士指导科研项目立项（19Z014）；2023年度河北省医学科学研究课题计划立项课题（20232135）DOI：10.20021/ki.16710770.2022.06.04Effects of Sr/TCP/OCP material on the activity and osteogenic differentiation of rat adipose tissuederivedstem cellsWANG Ningning，ZHANG Shengmin，YAO Shubo，QIU Yanli，WANG Jing，LIU Hongli，ZHOU Jing.Department of Stomatology，Cangzhou Medical College，Cangzhou，Hebei Province 061001，ChinaCorresponding author：ZHANG Shengmin，Email：【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of strontium/phosphate/octracalcium phosphate（Sr+TCP+OCP）material on rat adipose tissuederived stem cells（rADSCs）activity and osteogenic differentiation.MethodsSD rats were euthanasiaed，rADSCs osteogenesis induction was completed after primary rADSCs culture，Sr+TCP+OCP/OCP，TCP，OCP materials，divided into the 1%Sr+TCP+OCP，3%Sr+TCP+OCP，5%Sr+TCP+OCP，TCP，OCP and control（osteogenic induced media）groups.rADSCs proliferation was measured by methylthiazolyltetrazolium（MTT）.The alkaline phosphatase（ALP）activity and calcium content were detected.The rADSCs osteogenesisrelated proteins were detectd by Western blot（WB）.ResultsCompared with the control groupand 3%Sr+TCP+OCP group，the optical density（A）values of TCP，OCP in 1d，3d and 6d were decreased inthe TCP，OCP，1%Sr+TCP+OCP and 5%Sr+TCP+OCP groups（P0.05）.On d3 and d6，compared withthe 5%Sr+TCP+OCP group，the A value in the TCP group，OCP group and 1%SrTCP group were increased（P0.05）.The A value of each group increased in a timedependented manner（P0.05）.Compared with the con论著Sr+TCP+OCP 材料对大鼠脂肪来源干细胞活性及成骨分化的影响王宁宁，张圣敏，刘洪利，宋双荣，曹长红，刘俊红，霍景瑞，李琦沧州医学高等专科学校口腔系，河北 沧州061001通讯作者：张圣敏，Email：21解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1trol，TCP and OCP groups，the ALP activity and calcium ion in the 1%and 3%Sr+TCP+OCP groups were increased（P0.05），and the ALP activity and calcium ion content in the 5%Sr+TCP+OCP group were decreased（P0.05）.Compared with the 3%Sr+TCP+OCP group，the ALP activity and calcium ion in the 1%，5%Sr+TCP+OCP groups were decreaed（P0.05）.Compared with the 1%Sr+TCP+OCP group，the ALP activity and calcium ion in the 5%Sr+TCP+OCP group were decreaed（P0.05）.Compared with the control，TCP and OCPgroups，the Runt related transcription factor 2（Runx2），proliferating cell nuclear antigen（PCNA）in the 1%，5%Sr+TCP+OCP groups had decreased（P0.05）.Compared with the 3%Sr+TCP+OCP group，the Runx2 and PCNA had increased in the 1%，5%Sr+TCP+OCP groups（P0.05）.Compared with the 1%Sr+TCP+OCP group，the Runx2 and PCNA had increased in the 5%Sr+TCP+OCP groups（P0.05）.Conclusion3%Sr+TCP+OCPimproves rADSCs biological activity as well as osteogenic differentiation capacity，which might be related to regulatthe Runx2/PCNA signaling pathway.【Key words】Strontium/phosphate/occalcalcium phosphate；Adipose stem cells；Osteogenic differentiation；Proliferating nuclear antigen脂肪干细胞（Adipose stem cells，ADSCs）主要是从脂肪组织中提取分离出来，具有多向分化潜能的间质干细胞，同时在一定的条件下，可以分化为软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞等，是现在医学研究的热点1-2。磷酸三钙（tricalcium phosphate，TCP）的化学成分与人体骨的无机盐成分十分接近，同时具有较为优异的生物降解速率、生物相容性，当该材料植入人体后会通过吞噬细胞、物理化学溶解等方式进行3。磷酸八钙（Octacalcium phosphate，OCP）是近几年发现的一种新型生物活性材料，是骨骼、牙齿的主要成分，具有较强的降解能力，对于与其他的材料有较好的骨诱导性、骨传导性4-5。人体的锶（Sr）大部分存在于骨骼中，在骨的形成中具有重要作用，参与机体的生化过程6。本文旨在研究 Sr+TCP+OCP 材料对rADSCs 活性及成骨分化的影响，为研究生物性能优良的骨修复材料提供参考。1材料与方法1.1动物及材料1.1.1实验动物57月SD大鼠购自哈尔滨医科大学实验动物学部提供，合格证号：SYXK（黑）2019001，动物使用许可证：SYXK（冀）2020002；动物质量合格证号：WTLH202031316，批准文号：WYZLL 2020 0212）；体质量 230256 g，68 周龄，未交配。动物研究符合院内动物实验伦理审查要求，实验过程严格遵守动物实验“3R”原则。1.1.2实验材料CKX53 型倒置相差显微镜（济南爱来宝仪器设备）、钙试剂盒（上海邦景实业）、四甲基偶氮唑蓝（methylthiazolyltetrazolium，MTT）比色试剂盒（美国 Promega）、runt 相关转录因子 2（Runt related transcription factor 2，Runx2）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）试剂盒（上海科顺生物科技），胎牛血清及 DMEM（广州沛瑜生物技术），地塞米松、抗坏血酸、甘油磷酸钠均为分析纯（广州化学试剂厂），等。1.2方法1.2.1rADSCs 的提取及培养安乐处死 2 只 SD大鼠，在无菌条件下，将处死的大鼠浸泡在75酒精 10 min，置于无菌操作台，固定于大鼠手术架，取SD大鼠双侧腹股沟部脂肪组织，剔除组织周围的筋膜与血管，将 2 只的腹股沟部脂肪组织混合并剪碎成小块，置于无菌离心管，管内加入脂肪组织2倍体积的0.1%I型胶原酶消化，在37水浴并震荡消化 40 min，加入 2 倍体积的低糖 DMEM 完全培养液终止酶活性，在37、5%CO2恒温箱中培养，原代培养3 d换液体，当细胞生长达到80%，采用0.25%胰蛋白酶消化并进行传代，以第3代rADSCs细胞进行试验。1.2.2rADSCs 成骨诱导分化及鉴定取第 3 代rADSCs，当细胞贴壁生长80%融合时，加入成骨诱导培养液，即