miR-659-3p靶向C...调控甲状腺癌细胞凋亡的机制_张军.pdf

33(1):48Feb.,2023生物技术Biotechnology第 33 卷第 1 期2023 年 2 月 收稿日期:2021-08-31 作者简介:张军(1973-),男,硕士,副主任医师,从事甲状腺乳腺肿瘤研究,以第一作者发表中文核刊论文 3 篇,参与发表 SCI 论文 1 篇。开发与应用DEVELOPMENT AND APPLICATIONmiR-659-3p 靶向 CTNNBIP1 调控甲状腺癌细胞凋亡的机制张军,彭大伟,李鸽姿,李杰,李杏,陈嘉丽,吴淑宁(中南大学湘雅二医院深圳医院(深圳市前海蛇口自贸区医院)甲状腺乳腺外科,深圳 广东 518000)摘要:目的 探讨 miR-659-3p 在甲状腺癌细胞中的潜在功能和机制。方法 纳入甲状腺乳头癌患者 60 例,比较甲状腺患者癌旁组织和癌组织中 miR-659-3p 的表达水平。过表达或敲低 miR-659-3p 后检测甲状腺癌细胞 TPC-1 的增殖水平和凋亡水平,并进行底物鉴定。结果 miR-659-3p 的表达水平在 60 个 甲状腺癌组织中也显著上调(P 0.05)。miR-659-3p 敲低后 TPC-1 的增殖水平显著下降(P 0.05)、TPC-1 的凋亡水平显著上升(P 0.05)。敲低 CTNNBIP1 时,TPC-1 的凋亡水平下降(P 0.05)、TPC-1 的细胞活力水平上升(P 0.05)。过表达miR-659-3p 时,CTNNBIP1 的蛋白水平和 mRNA 水平显著下降(P 0.05);敲低 miR-659-3p 时,CTNNBIP1 的蛋白水平和 mRNA 水平显著上升(P 0.05)。过表达 miR-659-3p 后,Wnt/-catenin 通路的关键蛋白 -catenin 的核定位增多;敲低 miR-659-3p 后,-catenin 的核定位减少。结论 miR-659-3p 通过靶向 CTNNBIP1 mRNA 的3端非编码区减少 CTNNBIP1 的表达,促进了甲状腺细胞的增殖,抑制了额甲状腺癌细胞的凋亡。关键词:miR-659-3p;CTNNBIP1;甲状腺癌细胞;凋亡;-catenin中图分类号:Q784 文献标识码:A DOI:10.16519/ki.1004-311x.2023.01.0008Mechanism of miR-659-3p targeting CTNNBIP1 to regulate theapoptosis of thyroid cancer cellsZHANG Jun,PENG Da-wei,LI Ge-zi,LI Jie,LI Xing,CHEN Jia-li,WU Shu-ning(Department of Thyroid and Breast Surgery,Shenzhen Hospital,Second Xiangya Hospital,Central South University,Shenzhen 518000,China)Abstract:ObjectiveTo investigate the potential function and mechanism of miR-659-3p in thyroid cancer cells.Meth-odA total of 60 patients with thyroid papillary carcinoma were enrolled to compare the expression levels of miR-659-3p inpara-cancer tissues and cancer tissues of thyroid patients.After overexpression or knockdown of miR-659-3p,the prolifera-tion level and apoptosis level of TPC-1 of thyroid cancer cells were detected,and the substrate was identified.ResultThe ex-pression level of miR-659-3p was also significantly up-regulated in 60 thyroid cancer tissues(P 0.05).After miR-659-3p knockdown,the proliferation level of TPC-1 was significantly decreased(P 0.05),and the apoptosis level of TPC-1was significantly increased(P 0.05).When CTNNBIP1 was knocked down,the apoptosis level of TPC-1 decreased(P 0.05),and the cell viability level of TPC-1 increased(P 0.05).When miR-659-3p was overexpressed,the protein andmRNA levels of CTNNBIP1 were significantly decreased(P 0.05);when miR-659-3p was knocked down,the protein andmRNA levels of CTNNBIP1 were significantly increased(P 0.05).After overexpression of miR-659-3p,the nuclear locali-zation of -catenin,a key protein of the Wnt/-catenin pathway,increased;after knockdown of miR-659-3p,the nuclearlocalization of -catenin decreased.Conclusion miR-659-3p reduced the expression of CTNNBIP1 by targeting the3UTR of CTNNBIP1 mRNA,and it promoted the proliferation of thyroid cells and inhibited the apoptosis of frontal thyroidcancer cells.Keywords:miR-659-3p;CTNNBIP1;thyroid cancer cells;apoptosis;-catenin 甲状腺癌(TC)是内分泌系统中最普遍的癌症1。大约 83%的 TC 患者属于甲状腺乳头状癌(PTC)2。PTC 的危险因素包括基因突变和环境暴露3。大多数早期 PTC 患者在接受甲状腺切除术和放射性碘治疗后显示出良好的预后4。然而,如果存在转移,则复发率会大大增加5。因此,了解PTC 进展的分子机制仍然很重要。人类癌症的发生和发展常常伴随着 miRNA 的失调6。在 PTC 中,越 1 期张军,等:miR-659-3p 靶向 CTNNBIP1 调控甲状腺癌细胞凋亡的机制来越多的证据表明 miRNA 的异常表达有助于癌症进展7。对 PTC 患者的基因表达和匹配的 miRNA谱的分析揭示了调节 PTC 细胞增殖的 RNA-RNA相互作用网络8。为了研究 miRNA 和甲状腺癌之间的关系,本研究分析了在线数据集(GSE129880),发现 miR-659-3p 在 PTC 患者的癌组织样本中高表达9。miR-659-3p 在能够调控结直肠癌细胞和血癌细胞的增殖10。但是,关于 miR-659-3p在 PTC 中的作用尚未报到。因此,选取了 miR-659-3p 为研究对象,旨在探讨 miR-659-3p 在甲状腺癌细胞中的潜在功能和机制。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验材料纳入 2018 年 6 月-2020 年 6 月收治的甲状腺乳头状癌患者 60 例,其中男 14 例、女 46 例,平均年龄(49.34 15.23)岁。所有患者均签署书面知情同意书。所有患者术前均未接受放疗或化疗,术后立即将甲状腺乳头状癌组织和癌旁组织保存于液氮中。TPC-1 细胞购自 Procell 公司;NPA87 细胞购自广州一骏生物制品有限公司;KAT-5 细胞购自CRISPRBIO 公司;Nthy-ori3-1 细胞购自上海朝瑞生物科技有限公司。1.1.2 试剂DMEM,济南鑫贝西生物技术有限公司;Light-Cycler FastStart DNA Master SYBR Green I,roche 公司;miR-659-3p mimics、miR-659-3p inhibitor、siRNA 和过表达载体均由北京擎科合成;Lipo-fectamine 3000,广州瑞舒生物科技有限公司;TRIzol试剂,广东有道仪器科技有限公司;所有引物均购自上海生工;PrimeScriptTMRT Master Mix,广州环肽生物科技有限公司;CCK-8 试剂盒,奥默生物技术(上海)有限公司;膜联蛋白 V-FITC 细胞凋亡染色检测试剂盒,ThermoFisher 公司;CTNNBIP1、GAP-DH、-catenin 和 H3 的抗体,Abcam 公司;核蛋白提取试剂盒,上海吉至生化科技有限公司。1.1.3 仪器实时荧光定量 PCR 仪(型号:QuantStudio5),美国应用生物系统公司;凝胶成像系统(型号:Chemi-DocTMXRS+),美国伯乐公司;的流式细胞仪(型号:CytoFLEX),美国贝克曼库尔特公司。1.2 方法1.2.1 细胞培养与处理PTC 细胞系(TPC-1、NPA87 和 KAT-5)和正常细胞系 Nthy-ori3-1 均在含 10%FBS 的 DMEM中培养,置于 5%CO2、37 加湿培养箱中。用 Lipo-fectamine 3000 将 siRNA(50 nmol/L)转染到 TPC-1细胞中。1.2.2 实时荧光定量 PCR 检测 RNA 的表达水平用 TRIzol 试剂从 PTC 组织和细胞系中分离总RNA。单链互补 DNA(cDNA)是用 PrimeScriptTMRTMaster Mix 生成的。用 LightCycler FastStart DNAMaster SYBR Green 和每种经过验证的引物在LightCycler 96 中进行定量 RT-PCR。GAPDH 或 U6用作内参。1.2.3 免疫印迹检测 CTNNBIP1 的蛋白表达水平过表达或敲低 miR-659-3p 后用 RIPA 裂解缓冲液从 1 106个细胞中制备裂解物。核蛋白提取试剂盒提取核蛋白。用二辛可宁酸蛋白质测定试剂盒测定每个样品的浓度。将 20 g 蛋白质裂解液装入 8%SDS 凝胶中并通过电泳进行分离。凝胶上的蛋白质被转移到 PVDF 膜上。将膜用 5%脱脂牛奶在室温下封闭 1 h,然后与指定的一抗在 4 下孵育过夜。第 2 d,洗涤膜并与合适的二抗在室温下孵育1 h。最后,使用 ECL 蛋白质印迹底物对膜进行显影,并使用 ImageQuant LAS 4000 获得图像。1.2.4 甲状腺癌细胞凋亡水平检测用膜联蛋白 V-FITC 细胞凋亡染色检测试剂盒测量细胞凋亡。FACScan 流式细胞仪分析样品。1.2.5 甲状腺癌细胞增殖水平检测用 CCK-8 试剂盒测量细胞活力。将每孔 2000个细胞接种在 96 孔板中并在所述天数培养。然后加入 CCK8 溶液并通过 SpectraMax 微量滴定板读数器测定 450 nm 处的吸光度。1.2.6 双荧光素酶实验检测 miR-659-3p 靶向CTNNBIP1 从 TPC-1 细胞的 cDNA 中扩增