BDNF_TrkB_Akt...患儿中的作用及免疫反应分析_伍宗辉.pdf

口腔颌面外科杂志2023年2月 第33卷第1期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol33 No1 February,2023BDNF/TrkB/Akt/p-RPS6 信号通路在口腔上皮牙源性病变患儿中的作用及免疫反应分析伍宗辉，汪瑞芳（西安市儿童医院口腔科，陕西西安710002）摘要目的：分析BDNF/TrkB/Akt/p-RPS6信号通路在儿童口腔上皮牙源性病变中的作用及免疫反应。方法：以2018年6月2020年6月间本院收治的50例口腔上皮牙源性病变患儿的口腔上皮病变组织标本（病例组）和50例健康儿童的口腔上皮组织标本（对照组）为研究对象，均行BDNF/TrkB/Akt/p-RPS6信号通路蛋白检测、免疫功能T细胞亚群（CD3+、CD4+、CD4+/CD8+）检测和免疫球蛋白指标（IgG、IgA、IgM）检测，对比对照组和病例组上述指标的差异，并采用Pearson相关性分析法分析BDNF/TrkB/Akt/p-RPS6信号通路蛋白与免疫功能相关指标的相关性。结果：病例组的脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、酪氨酸激酶受体B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）、蛋白激酶B（protein kinase B，PkB，又称Akt）、磷酸化S6核糖体蛋白抗体（anti-phospho-S6 ribosoma protein，p-RPS6）的平均光密度值均高于对照组（P0.05）。病例组的免疫功能T亚群细胞（CD3+、CD4+、CD4+/CD8+）、免疫球蛋白指标（IgG、IgA、IgM）数据值均低于对照组（P0.05）。BDNF、TrkB、Akt、P-RPS6的平均光密度值与免疫功能T细胞亚群（CD3+、CD4+、CD4+/CD8+）数据值、免疫球蛋白指标（IgG、IgA、IgM）数据值呈负相关（均P0.05）。结论：口腔上皮牙源性病变患儿存在明显的BDNF/TrkB/Akt/p-RPS6信号通路相关蛋白表达异常和免疫功能抑制，且免疫功能抑制与BDNF/TrkB/Akt/p-RPS6信号通路蛋白异常表达相关。关键词BDNF/TrkB/Akt/p-RPS6信号通路；口腔上皮牙源性病变；免疫反应中图分类号 R782文献标志码 ADOI:10.3969/j.issn.1005-4979.2023.01.003Analysis of BDNF/TrkB/Akt/p-RPS6 signaling pathway in children withoral epithelial odontogenic lesionWU Zonghui,WANG Ruifang(Department of Stomatology,Xian Childrens Hospital,Xian 710002,Shaanxi Province,China)Abstract Objective:To analyze the role and immune response of BDNF/TrkB/Akt/p-RPS6 signaling pathways in chil-drens oral epithelial odontogenic lesions.Methods:Tissue specimens from 50 children with oral epithelial odontogenic le-sions(odontogenic lesion group)and 50 oral epithelial tissue samples(control group)who were treated in our hospital fromJune 2018 to June 2020 were selected.In all samples,proteins in BDNF/TrkB/Akt/p-RPS6 signaling pathway,immunefunction T cell subsets(CD3+,CD4+,CD4+/CD8+)and immunoglobulin indexes(IgG,IgA,IgM)were detected to compare thedifferences of the above indexes between healthy group and odontogenic lesion group.Pearson correlation analysis wasused to analyze the correlation between signal pathway protein and immune function related indexes.Results:The averageoptical density of brain-derived neurotrophic factor(BDNF),tyrosine kinase receptor(TrkB)，protein kinase B(PkB,alsoknow as Akt)and anti-phospho-S6 ribosoma protein(p-RPS6)in odontogenic lesion group was higher than that in controlgroup(P0.05).The data of immune function T cell subsets(CD3+,CD4+,CD4+/CD8+)in odontogenic lesion group werelower than those in control group(P0.05).The data of immunoglobulin indexes(IgG,IgA,IgM)in odontogenic lesiongroup were lower than those in control group(P0.05）。1.2主要试剂与仪器一抗稀释液、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel elec-trophoresis,SDS-PAGE）试剂盒（上海碧云天生物技术公司，中国）；BCA蛋白定量试剂盒（北京索莱宝科技公司，中国）；ECL化学发光试剂盒（上海易佰聚经贸有限公司，中国）；人抗p-RPS6抗体、人抗TrkB抗体、人抗BDNF抗体、人抗Akt抗体、人抗GAPDH抗体（北京博奥森生物技术公司，中国）；HRP标记羊抗兔、多聚甲醛（国药集团化学试剂北京有限公司，中国）；免疫组织化学检测试剂盒（CST公司，美国）；Mini-protean Tetra System垂直电泳槽转膜仪、Mini trans-blot小型湿转印槽、ChemiDoc XRS+凝胶成像系统（Bio-Rad公司，美国）；Max200超级酶标仪、FACSECalibur流式细胞分析仪（Bio-Tek公司，美国）；TE2000-U+DXM1200倒置显微镜、Z36HK高速冷冻离心机（Nikon公司，日本）。1.3方法1.3.1BDNF/TrkB/Akt/p-RPS6信号通路蛋白检测取口腔上皮组织标本，用4%多聚甲醛固定，并进行石蜡包埋、冠状切片，将其用于Western blot-ting、免疫组织化学检测。按免疫组织化学试剂盒说明书进行操作，即将切片作脱蜡、水化处理后，用3%过氧化氢去离子水孵育10 min后，以磷酸盐缓冲液（phosphate bufferedsaline，PBS）洗涤3次，每次2 min，然后滴加一抗，以37 孵育12 h，再以PBS冲洗2 min，冲洗3次，滴加试剂标准液，以37 孵育20 min，以PBS洗涤3次，每次2 min，滴加试剂检测物抗体溶液，以37 孵育20 min，再以PBS液冲洗3次，每次2 min，使用DAB溶液进行显色，显色后进行冲洗、复染、脱ulin indexes(IgG,IgA,IgM)(all P0.05).Conclusion:There were obviously abnormal expression of BDNF/TrkB/Akt/p-RPS6 signal pathway related proteins and immunosuppression in patients with oral epithelial odontogenic lesions,and im-munosuppression was related to abnormal expression of BDNF/TrkB/Akt/p-RPS6 signal pathway proteins.KeywordsBDNF/TrkB/Akt/p-RPS6 signaling pathway;oral epithelial dental lesions;immune response15口腔颌面外科杂志2023年2月 第33卷第1期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol33 No1 February,2023水、透明、封片等处理，最后进行图像分析。免疫组织化学HE染色阳性表达成分在图像上呈红色颗粒，以平均光密度值来表示。于组织切片中加入裂解液进行裂解，在冰上充分混匀，裂解与混匀重复3次，然后以12 000 r/min的转速作离心处理，共30 min，取上层清液，将其置于无菌离心管，采用BCA法测定蛋白浓度，用SDS-PAGE制胶试剂盒配制8%分离胶和5%浓缩胶，上样抗体蛋白30 g进行电泳，然后将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上后用TBST缓冲液洗膜3次，每次5 min，用5%脱脂奶粉封闭2 h，再采用TBST溶液洗膜3次，每次8 min，4 下过夜进行一抗孵育（p-RPS6以11 000稀释，Akt以11 000稀释，TrkB以11 000稀释，BDNF以11 000稀释，内参GAPDH以110 000稀释），再采用TBST溶液洗膜3次，每次10 min，二抗室温下孵育2 h，再采用TBST溶液洗膜3次，每次20 min。最后应用化学发光法进行显影曝光，凝胶成像系统进行扫描分析，以目的蛋白与内参GAPDH灰度值之比表示蛋白的相对表达量。1.3.2免疫相关指标检测取患者外周血2 mL，采用FACSCalibur流式细胞分析仪进行CD3+、CD4+、CD8+、NK的检测，并计算CD4+/CD8+值，采用德国全自动化学发光免疫分析仪及配套试剂，行血清IgG、IgA、IgM等免疫免疫球蛋白检测，检测操作严格按照试剂盒说明书进行。1.4统计学方法采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。BDNF/TrkB/Akt/p-RPS6信号通路蛋白表达量等数据以均数标准差（xs）表示，性别等资料以频率表示。正态计量资料以t检验分析，不符合正态分布的计数资料以2检验分析。采用Pearson相关性分析法分析BDNF/TrkB/Akt/p-RPS6信号通路蛋白与免疫功能相关指标的相关性。以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1典型病例男患儿，7岁6个月，2019年2月因右下后牙区肿胀就诊。曲面断层片显示右侧下颌骨一单囊状放射性透光影，界限清晰，43牙倾斜明显（图1A），考虑颌骨囊肿或牙源性角化囊性瘤可能。治疗：拔除84、85牙并行颌骨囊肿开窗引流术，切取部分囊壁送病理，病理结果为牙源性角化囊性瘤。术后3个月复查，复查曲面断层片可见肿物缩小、部分骨组织再生（图1B），随后行下颌骨肿物切除术。术后6个月复查，创口愈合良好。曲面断层片显示下颌术区创腔内成骨良好，43牙倾斜程度改善（图1C）。病理图片见图1D。2.2对照组和病例组BDNF/TrkB/Aktt/p-RPS6信