DR患者外周血miR-12...与视网膜病变严重程度的关系_田甜.pdf

基金项目云南省教育厅科学研究基金项目（2019J1123）收稿日期2021-10-29修回日期2022-06-15第一作者简介田甜，实验师，主要从事常见眼科疾病和屈光不正诊治研究。糖尿病是最常见的以高血糖为特征的代谢性疾病，由内源性胰岛素分泌不足或作用缺陷引起。据估计，到 2040 年全球范围内 2079 岁糖尿病患者将增至约 6.42 亿，比 2015 年增加 62%1，2 型糖尿病患者约占糖尿病患者的 90%95%。由于高血糖和胰岛素抵抗综合征，2 型糖尿病患者发生大血管和微血管并发症的风险较高，如心血管疾病、糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）、糖尿病肾病和糖尿病神经病变等2。高血糖会导致机体氧化应激增加，使神经视网膜组织和微血管系统的适应性受到炎症攻击，从而引发 DR3。临床上，DR 可根据严重程度分为非增殖型和增殖型。若处于非增殖型的 DR 患者眼血管层存在病变，眼底可出现微血管瘤、出血、渗出或黄斑水肿等。增殖型糖尿病视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy，PDR）的特征是病理性视网膜新生血管形成和视网膜血管渗漏，严重者伴发新生血管性青光眼等并发症导致视力丧失。DR 是 2074 岁成年人新发失明的最常见原因，早期诊断和有效的治疗可以延迟 DR 发生、进展4。因此，识别与 DR 严重程度相关的临床诊断生物标志物可能有利于 DR 的早期检测和管理。微 RNA（microRNA，miRNA）是一种由 2123 个核苷酸组成的非编码 RNA，作为转录后调节因子可通过靶向 mRNA 的 3-非翻译区来调节基因表达。越来越多的证据表明，miRNA 可以通过调节细胞增殖、迁移和凋亡等细胞生物学过程来调节 DR 进展5。如 miR-219-5p 通过肝受体同系物-1/Wnt 信号通路调控人视网膜色素上皮细胞凋亡改变 DR 的发展；miR-152 可以通过靶向 LIN28B 抑制视网膜色素上皮细胞中由高糖引起的血管生成。作为miRNA 家族的重要成员，miR-122 和 miR-1281 被证明参与胃癌、肝癌及缺血性脑卒中等疾病的调控，且已被证实在糖耐量受损的患者中其表达水平显著升高。目前关于 miR-122 和 miR-1281 是否在DR 中存在表达异常且是否与疾病严重程度存在关联，尚不清楚。本研究通过对 DR 患者外周血 miR-DR 患者外周血 miR-1281 和 miR-122 的变化及其与视网膜病变严重程度的关系田甜，严晶，代娇（曲靖医学高等专科学校，云南曲靖655000）摘要目的：探究糖尿病视网膜病变（DR）患者外周血 miR-1281 和 miR-122 的变化及临床意义。方法：选取 2 型糖尿病非视网膜病变患者（NDR 组）55 例、非增殖型 DR 患者（NPDR 组）42 例、增殖型 DR 患者（PDR 组）30 例及健康人群 40 例（对照组）作为研究对象，使用实时荧光定量聚合酶链反应测定其血清 miR-122 和 miR-1281 的相对表达量。结果：NPDR 组和 PDR 组患者血清 miR-122 水平显著高于对照组和 NDR 组，且 PDR 组患者显著高于 NPDR 组，差异有统计学意义（P0.05）；miR-1281 水平在 NDR 组、NPDR 组和 PDR 组中均显著高于对照组，且其表达水平在 NDR 组、NPDR 组和 PDR 组中显著上升，差异有统计学意义（P0.05）。血清 miR-122 和 miR-1281 与患者病程、糖化血红蛋白及 HOMA-IR 指数均存在显著正相关；miR-122 和miR-1281 对于鉴别增殖型 DR 的曲线下面积分别为 0.81 和 0.86。结论：血清 miR-122 和 miR-1281 表达在 DR 患者中增加，可用作 DR 严重程度的评价指标。关键词miR-122；miR-1281；2 型糖尿病；糖尿病视网膜病变；诊断中图分类号R446文献标志码A文章编号2096-2266（2023）02-0056-06DOI10.3969/j.issn.2096-2266.2023.02.010大理大学学报JOURNAL OF DALI UNIVERSITY第8卷第2期2023年2月Vol.8No.2Feb.2023561281 和 miR-122 的变化情况，探讨其与视网膜病变严重程度的关系，现报道如下。1对象与方法1.1研究对象选取 2020 年 2 月至 2021 年 9 月在曲靖市第二人民医院内分泌科住院的 2 型糖尿病患者作为研究对象。纳入标准为符合世界卫生组织公布的 2 型糖尿病诊断标准者；排除标准为患有高血压、冠心病、严重肺部疾病、严重肝肾疾病、严重感染或肿瘤者。根据上述标准最终纳入患者 127例，通过查看病历资料收集患者的年龄、性别、体重指数（body mass index，BMI）和糖尿病病程。由 2 名经验丰富的眼科视网膜专家根据美国眼科协会制定的糖尿病视网膜病变临床实践指南6对纳入研究的糖尿病患者行视网膜病变评估，并基于眼底照片和荧光素眼底血管造影结果加以判断。根据评估结果将患者分为 3 组，其中，非 DR 者 55 例纳入NDR 组、非 PDR 者 42 例纳入 NPDR 组、PDR 者 30例纳入 PDR 组。选取同期健康人群 40 例为对照组。本研究通过曲靖市第二人民医院医学伦理委员会审批通过，所有纳入研究者签署知情同意书。1.2样本收集及处理收集空腹静脉血，所有血样在 25、1 200 g 条件下离心 10 min，分离血清并保存于-80 冰箱中备用。使用 miRNeasy Serum/Plasma 试剂盒（QIAGEN，批号：217184）分离总RNA，洗脱体积为 14 L。洗脱后，RNA 样品储存于-80 冰箱中备用。1.3实验室资料使用日立 7600 全自动生化分析仪测定空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、糖化血红蛋白（glycosylatedhemoglobin，HbA1c）、肌酐（creatinine，Cr）和血脂，血脂包括总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）。使用罗氏 Combase602 全自动电化学发光仪测定空腹血清胰岛素（fasting serum insulin，FINS）水平，通过HOMA-IR 指数评估胰岛素抵抗水平7。HOMA-IR指数=FINS（U/mL）FBG（mmol/L）/22.5。1.4miR-122 和 miR-1281 的扩增将提取的总RNA 在 ABI 7500 PCR 仪中反转录成 cDNA，反应体系为 10 L。相关引物序列由上海生工生物工程公司设计合成。见表 1。以每孔 1 L 的 cDNA 为模板，U6 作为内参，运用实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒检测 miR-122 和 miR-1281 的表达情况。每个样本设置 3 个复孔，反应程序为 95 10 min 预变性；95 10 s，60 20 s，72 10 s，40 个循环。miR-122 和 miR-1281 的表达量采用 2-Ct法进行相对定量。表 1miR-122 和 miR-1281 的引物序列1.5统计分析采用 SPSS 22.0 软件对实验数据进行统计分析，计量资料用（xs）表示，组间比较使用独立样本 t 检验；计数资料用 n（%）表示，组间比较使用单因素方差分析；使用 Spearman 相关性分析法对 miR-122、miR-1281 与其他指标的相关性进行分析，P0.05 为差异有统计学意义；使用受试者操作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC 曲线）判断 miR-122 和 miR-1281 的诊断性能。2结果2.1一般资料及实验室指标比较从 4 组人群的一般资料及实验室指标比较结果可以看出，除FBG、HbA1c 和 HOMA-IR 指数差异有统计学意义（P0.05）外，其他指标差异均无统计学意义（P 0.05）。FBG、HbA1c 和 HOMA-IR 指数水平随着 3组患者病情的加重而升高，其数值均为 PDR 组高于NPDR 组，NPDR 组高于 NDR 组，差异有统计学意义（P0.05）。见表 2。2.2miR-122 和 miR-1281 表达水平的比较与对照组比较，除 NDR 组患者血清 miR-122 表达水平差异无统计学意义外，其他组别患者血清 miR-122和 miR-1281 表达水平差异均有统计学意义（P0.05）；与 NDR 组比较，NPDR 组和 PDR 组患者血清miR-122 和 miR-1281 表达水平显著升高，差异有统计学意义（P0.05）；PDR 组患者血清 miR-122 和基因引物序列miR-122正向：5-AGTGGAGTGTGACAATGGT-3反向：5-CCAGTTTTTTTTTTTTTTTCAAACACC-3miR-1281正向：5-TCGCCTCCTCCTCTCC-3反向：5-GAACATGTCTGCGTATCTC-3U6正向：5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3反向：5-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3田甜，严晶，代娇DR 患者外周血 miR-1281 和 miR-122 的变化及其与视网膜病变严重程度的关系总第 86 期第 8 卷57项目对照组（n=40）NDR 组（n=55）NPDR 组（n=42）PDR 组（n=30）年龄/岁48.367.8947.798.1248.897.6249.3311.2022（55.00）29（52.73）23（54.76）17（56.67）18（45.00）26（47.27）19（45.24）13（43.33）病程/年4.191.359.122.8513.653.85BMI/（kg/m2）22.832.3522.691.8923.011.9223.122.05FBG/（mmol/L）4.750.446.280.62*7.050.67*8.170.80*HbA1c/%4.310.886.310.67*7.350.69*#8.190.82*#&TC/（mmol/L）4.150.994.251.124.301.024.421.15LDL-C/（mmol/L）3.240.683.350.703.360.823.410.90TG/（mmol/L）1.460.511.480.821.530.781.570.86Cr/（mol/L）58.697.8559.687.9861.588.9662.5810.35FINS/（mIU/L）5.580.895.691.085.721.155.851.32HOMA-IR 指数1.260.391.380.441.630.62*#1.820.63*#&性别男女注：与对照组比较*P0.05，与 NDR 组比较#P0.05，与 NPDR 组比较&P0.05。表 2一般资料及实验室指标比较miR-1281 表达水平显著高于 NPDR 组，差异有统计学意义（P0.05）。见图 1。注：A 为 miR-122，B 为 miR-1281；与对照组比较*P0.05，与 NDR 组比较#P0.05，与 NPDR 组比较&P0.05。图 1各组间血清 miR-122 和 miR-1281表达水平比较2.3miR-122 和 miR-1281 水平与 DR 患者临床资料相关性分析相关性结果显示，所有 DR 患者（仅包含 NPDR 组和 PDR 组患者）血清 miR-122 和miR-1281 与病程、HbA1c 和 HOMA-IR 指数存在显著正相关，与其他指标的相关性不显著。见表 3。表 3miR-122 和 miR