COPD中MicRNA-3...RPINA1基因表达的研究_任杰.pdf

论著 收稿日期 基金项目 新疆维吾尔自治区自然科学基金（）作者简介 任杰（），男，安徽阜阳人，新疆维吾尔自治区喀什地区第一人民医院副主任医师，医学硕士，从事呼吸与危重系统疾病诊治研究。通信作者。：中 调节 基因表达的研究任杰，祖力皮喀尔阿卜杜热合曼，弓慧，钟雪梅，郑爱芳，李黎（新疆维吾尔自治区喀什地区第一人民医院呼吸与危重症医学科，新疆 喀什 ）摘要目的 通过双荧光素酶报告系统验证 对 基因的靶向调控关系。方法 从人正常肺上皮细胞基因组库中获取 基因的 序列，并通过序列匹配拟定候选 。利用香烟烟雾提取物（，）诱导人支气管上皮细胞（细胞）建立慢性阻塞性肺疾病（，）细胞模型作为实验组，正常培养的 细胞作为对照组，使用实时荧光定 量 聚 合 酶 链 反 应（，）法 检 测 两 组 和候选 的表达水平。构建野生型及突变型双荧光素酶报告基因载体，分别将双荧光素酶报告质粒（和 ）和 质 粒（）共转染到 细胞，进行荧光活性测定。结果 通过序列匹配，拟候选 、和 为目标 。与对照组相比，实验组 基因 表达水平显著上调（），四个候选 表达水平均显著下调（），其中 和 更为显著（），基于文献 与 的预后相关，挑选 用于后续双荧光素酶实验。携带 和 野生型，的构建体的相对荧光素酶活性明显下降（），突变型 的构建体的相对荧光素酶活性无明显下降（）。结论 在 诱导的 细胞中表达上调，表达下调，可能通过负向调控 的表达，在 的发生发展过程中起重要作用。关键词肺疾病，慢性阻塞性；荧光素类；：中图分类号 文献标志码 文章编号 （），（，）（）（）（），（第 卷第期 年月河北医科大学学报 ）（）（），（），（），（），（），（），；慢 性 阻 塞 性 肺 病（，）是一种原因复杂的异质性疾病。是 家族成员，是编码 抗胰蛋白酶（，）的关键基因，缺乏是与 有关的遗传危险因素。本团队前期研究发现，基因 可 能 与 维 吾 尔 族 的 发 病 有 关，基因 与喀什地区 易感性 无 明 显 相 关 性。有 研 究 报 道，的单核苷酸多态性可增高人群 的患病风险。因此，在 发生发展中具有重要作用，目前关于 中 与 相互的靶向调控关系的研究报道较少，其机制尚不完全清楚。材 料 与 方 法材料载体、菌种及细胞 感受态细胞购自天根公司，细胞、人正常肺上皮细胞系（）购 自 公 司（货 号 ）。载体和 报告基因检测试剂盒购自 公司。酶及主要试剂总 提取试剂 、转染 试 剂 购 自 公司；提 取 试 剂 盒（，）、转录试剂盒（，）均购自 公司；酶、连接酶购自 公司；胶回收和质粒小提试剂盒购自北京天根生物技术有限公司；点突变试剂盒购自 公司 。模拟物（）由 公司设计并合成。高 糖、培 养 液 购 自 公 司，胰 蛋 白 酶、和 购 自 公 司；和 均购自 公司。及其阴性对照片段 购自上海吉玛生物科技公司产品；特异性引物和定量 引物购自上海生工。方法 细胞模型的建立 的制备，方法参照文献 。取一支香烟均速从装有 注射器中冒出，这种培养 液 定 义 为 浓 度 的 香 烟 烟 雾 提 取 物（，）。每 次 需要新鲜制备，并使用 稀释到最终工作浓度（浓度比），在 内使用。正常 当细 胞 汇 合 度 达 到 为 时，用 处理，即 细胞模型。后续进行基因表达检测。检测目标 和 基 因 表 达将 人 正 常 肺 上 皮 细 胞 系（）和 细胞培养至 收集细胞。河 北 医 科 大 学 学 报第 卷第期使用 公司 试剂盒提取细胞 ，试剂盒进行 转录。法提取细胞总 。紫外分光光度计测定 、值后，进行反转录。基因引物，：；：（位置 ，产物长度 ）。上游检测引物（）如下：，：，：，：。使用 法对 水平的表达进行定量分析。结果分析时，获得基因的 值，取基因 值与 基因浓度值的比值作为基因相对表达量。报告基因载体构建取人正常肺上皮细胞系（），使用酚氯仿抽提基因组，设 计 引 物 使 用酶 进 行 扩 增 基因 区域，使用 和 双酶切 产物和 载体后，连接酶进行 连接反应，热激转化 感受态细胞，挑 取 阳 性 克 隆 提 取 质 粒。阳 性 质 粒 标 记 为 。以为 质粒为模板，设计点突变引物，使用 公司 试剂盒按照说明书进行 分 子 靶 位 点 突 变，突 变 后 质 粒 命 名 为 。基因 区域参照 序列（），扩 增 引 物 如 下，：；：（位置 ，产物长度 ）。点突变有两对引物，序列如下，：；：（斜 体 序列为 分子靶位点，下划线为突变位点，原序 列 为 ）；：（斜体序列为 分子靶 位 点，下 划 线 为 突 变 位 点）；：。扩 增 采用如下体系：聚合酶（），（），（），上下游引物（）各，模板（），补水至；反应程序：；，个循环；延伸 。细胞转染将 细胞接种于孔板中，密度为 个孔，用含 的 培养液培养，细胞融合度达 进行后续的转染。按照说明书溶解 模拟物以及阴性对照 ，浓度为 。在聚丙烯管里准备 和 复合物：在聚丙烯管中加入 预热的 培养基，加入 模拟物 和 的野生型和 突变型质粒，轻轻混匀后室温放置 。在另一个管中加入 预热的 培养基，再加入 。轻轻混 匀后 室 温 放置 。将上 述 稀 释 好 的 与脂质体混合。混合物置于室温孵育 。后，移去脂质体和 复合物，在每个培养皿中重新加入新鲜的培养液，转染 后收集细胞，检测 报告基因活性。报告基因检测选取转染 后 细胞，用 冲洗细胞遍后，加入 裂解液 ，室温下裂解 。离心 ，吸取上清液进行检测。将 试剂盒中 液加入 孔酶标板中，将 细胞溶解物转移到含有 液的酶标板中，吹打混匀。在多功能酶标仪上检测 荧光素酶读数。加入 ，短暂混匀后测定 荧光素酶读数。样品的相对荧光素酶活性即为 荧光素酶读数。统计学方法应用 统计学软件进行数据分析。计量资料比较采用检验，三组间采用单 因 素 方 差 分 析。为 差 异 有 统 计 学意义。结果 细胞中个 本底表达水平结果在 细胞株中提取总，应用 荧 光 定 量 方 法 分 别 对 、进 行 反 转 录 扩增，用 作 为 内 参，结 果 显 示 及 的表达量明显低于其他，表达值分别为、（），为 表达上 调（），中 、表 达 均 下调，表达上调，与对照组比较，差异有统计学意义（），见表。与 的结合及突变位点本研究通过生物信息学预测软件预测 河 北 医 科 大 学 学 报第 卷第期 和 的 存在互补结合位点，同时构建 的突变位点，见表。表 细胞中个 本底表达水平结果 （，）组别 对照组 值 值 表 与 的结合及突变位点 序列 和 的结合位点（斜体）及突变位点（下划线）双 荧 光 素 酶 活 性 结 果为 了 进 一 步 验 证 是否调控 中的表达，本 研 究 将 与 野 生 型 或 突 变 型 结合，然后将双荧光素酶报告质粒转染到 细胞，使用 阴性对照作为对照组，检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的发光。结果显示，和 野生型 构建体的相对荧光素酶活性明显下降，和对照组相比差异有统计学意义（），而在 突变型 构建体的相对荧光素酶活 性 无 明 显 下 降，差 异 有 统 计 学 意 义（），结 果 表 明，可 以 直 接 靶 向 的 序 列，是 的直接靶基因。荧光素酶数值：与 比较，差异有统计学意义（）.（），；与 比较，差异无统计学意义（）.（），。讨论 基因多态性与环境因素共同增加疾病发展的风险，其临床表现和致病机制存在异质性。（）是 大小的非编码，通过与 的 结合来调控基因表达，参与细胞增值，细胞周期调控等过程。研究显示，在 中参与细胞通信，气道上皮重塑和 炎 症 免 疫 等 过 程。有 研 究 表 明，血 液 中 家族表达下调，降低生存率，在 中 表 达 下 调，负 调 控 的 表达。抗 胰 蛋 白 酶 缺 乏 症（，）可由 的双等位基因突变引 起，是 发 病 的 重 要 遗 传 危 险 因 素，基因突变可增加 患病风险，其病理生理作用由表达、调控或转录后修饰的差异决定。研 究 表 明，醌 氧 化 还 原 酶（）可结合 ，可 能 与 抑 制 翻 译 的 结合，促进 的翻译，增强抗胰蛋白酶的表达（）。对 翻译的影响是否由其他 的相互作用来调节尚 不 清 楚。在 基 因 转 移 后，还 检 测 到 和单体的显著减少（），表达降低是由于 聚合物降解增加，进而导致 活化及白细胞介素减少，激活的 和白细胞介素均能促进 的转录。肝脏 活性降低可促进 基因表达及肝脏修复。通过与编码区或非编码区（非翻译区 和 ）中的靶 序列互补结合来调节基因表达，这些非编码 的表达改变已被证明与 发病及预后相关。既往研究显示，在 患者中 存在差异性表达，部分上调（、和 ）部 分 下 调（、和 ）。本 研 究 发 现，在 细 胞 中 、及 表达均降低（），有研究显示，在 患者血浆中上调，可作为 的早期诊断标志物，本研究结果与之存在差异，同类研究显河 北 医 科 大 学 学 报第 卷第期示 在 存活和非存活患者之间存在明显差异性高表达，与生存周期呈正相关，且在白细胞中表达，参与免疫调节，抑制与 相关的癌症的发展，本研究结果与之相符。在呼吸系统疾病中的影响表现各异，依赖于其表达调控作用。本研究显示，在 细 胞 中 呈 现 高 表 达。基因的 与中国人群中患 的高风险相关，而关于 与 的相关研究较少。动物实验研究表明，可增加体内肺脏及肝脏 蛋白的含量，与本研究 在 细 胞 中 表 达 量 上 调 结 果 相 符，进 一 步 佐 证 了 影响 的表达调控。既往研究显示，在肺囊性纤维化等相关肺部疾病中 可以结合同源序列来抑制靶向 （编码基因）的 的表达，为靶向治疗提供替代策略，而在 中缺乏相关研究，的表达上调与 的表达下调是否存在靶向性的关系尚不明确，未见相关报道，本研究结果显示过表达 后的相对荧光素酶活性明显下降，而 突 变 后 的 荧 光 素 酶 活 性 无 显 著 下 降（），结果 表 明 与 的 序 列 存 在 靶 向 性 关 系，负 调 控 的表达。综上所述，本实验利用 发现 在 中低表达，高表达，验证了 可负调控 的表达，为进一步研究 在 中发生发展机制中的作用提供了实验基础，提供治疗方向。但对 如何调节 的表达及是否受相应炎症因子调节通路的影响，有待进一步的探究，目前仍缺乏 中 的综合性研究，可为 的治疗策略提供新的治疗靶点和方向。参考文献 ，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）（），（）：，（）：（本文编辑：杜媛鲲）任杰等 中 调节 基因表达的研究