miR-550a-3靶向N...CC827增殖、迁移和侵袭_胥杰.pdf

第 33 卷第 1 期2023 年 2 月生物技术Biotechnology33(1):75Feb.,2023 收稿日期:2021-12-23 作者简介:胥杰(1986-),男,四川省绵阳人,硕士,主治医师,研究方向:支气管哮喘与气道炎性改变,肺癌基因、蛋白表达与诊疗,E-mail:。通讯作者:周贵星(1984-),男,山东省枣庄人,学士,主治医师,研究方向:慢性阻塞性肺疾病的气道重塑、非小细胞肺癌诊疗,E-mail:123841359 。miR-550a-3 靶向 NFIC 表达调控肺癌细胞 HCC827 增殖、迁移和侵袭胥杰,崔继涛,狄红红,周贵星(滕州市中心人民医院呼吸与危重症二科,山东 滕州 277500)摘要:目的 探讨 miR-550a-3 靶向 NFIC 表达调控肺癌细胞 HCC827 增殖、迁移和侵袭作用。方法 检测40 例肺癌患者癌组织和癌旁组织中 miR-550a-3 和 NFIC mRNA 表达,并分析 NFIC 表达与肺癌患者病理特征的相关性。按Lipofectamine 2000 方法分别将 miR-NC、miR-550a-3 mimics 和 miR-550a-3inhibitor 转染到 HCC827 细胞,48h 后检测细胞增殖、迁移和侵袭情况,同时检测细胞中 miR-550a-3 和 NFIC mRNA 表达,并检测细胞中 NFIC、E-cadher-in 和 N-cadherin 蛋白表达。结果肺癌组织中 miR-550a-3 表达水平(1.83 0.19)高于癌旁组织(1.00 0.15),NFIC mRNA 表达水平(0.62 0.14)低于癌旁组织(1.00 0.10)(P 0.05);以 miR-550a-3 mRNA 均数为标准,将肺癌患者分为高表达组(22 例)和低表达组(18 例),miR-550a-3 与病理类型和 TNM 分期相关(P 0.05)。转染 miR-550a-3 后,miR-550a-3 mimics 组细胞中 miR-550a-3mRNA、细胞增殖率、迁移细胞数、侵袭细胞数和 N-cadherin 水平较 miR-NC 组增加(P 0.05),NFIC mRNA 及蛋白、E-cadherin 水平较 miR-NC 组降低(P 0.05);miR-550a-3 inhibitor 组细胞中 miR-550a-3 mRNA、细胞增殖率、迁移细胞数、侵袭细胞数和 N-cadherin 水平较 miR-NC 组降低,NFIC mRNA 及蛋白、E-cadherin 水平较 miR-NC 组增加(P 0.05)。结论 通过基因干预技术,降低 miR-550a-3 表达能靶向增加 NFIC mRNA 及蛋白表达,抑制HCC827 增殖、迁移和侵袭。关键词:miR-550a-3;NFIC;肺癌;细胞增殖;细胞迁移;细胞侵袭中图分类号:R734.2 文献标识码:A DOI:10.16519/ki.1004-311x.2023.01.0012Proliferation,migration and invasion of lung cancer cell HCC827 regulatedby miR-550a-3 targeting NFIC expressionXU Jie,CUI Ji-tao,DI Hong-Hong,ZHOU Gui-xing(Department of Respiratory and Critical Care,Central Peoples Hospital of Tengzhou City,Tengzhou 277500,China)Abstract:Objective To investigate the effect of miR-550a-3 targeting NFIC expression to regulate the proliferation,mi-gration and invasion of lung cancer cell HCC827.Method The expression of miR-550a-3 and NFIC mRNA in cancer tis-sues and adjacent tissues of 40 lung cancer patients was detected,and the correlation between NFIC expression and pathologicalcharacteristics of lung cancer patients was analyzed.The miR-NC,miR-550a-3 mimics and miR-550a-3inhibitor weretransfected into HCC827 cells respectively according to Lipofectamine 2000 method,and cell proliferation,migration and inva-sion were detectd after 48h,and at the same time,miR-550a-3 and NFIC mRNA expression in the cells were detected andNFIC,E-cadherin and N-cadherin protein expression in cells were detcted.Result The expression level of miR-550a-3in lung cancer tissue(1.83 0.19)was higher than that in adjacent tissue(1.00 0.15),and the expression level of NFICmRNA(0.62 0.14)was lower than that in adjacent tissue(1.00 0.10)(P 0.05).Based on the mean of miR-550a-3 mRNA,lung cancer patients were divided into high expression group(22 cases)and low expression group(18 cases),miR-550a-3 was correlated with pathological type and TNM stage(P 0.05).After transfection of miR-550a-3,the miR-550a-3 mRNA(1.63 0.20),the cell prolif-eration rate,the number of migrated cells,the number of invasive cells and the level of N-cadherin in the miR-550a-3mimics group were significantly higher than those in the miR-NC group,NFIC mRNA and protein,E-cadherin levels werelower than those in the miR-NC group(P 0.05);and miR-550a-3(0.58 0.04),cell proliferation rate,number of生 物 技 术2023 年migrated cells,number of invasive cells and N-cadherin level in miR-550a-3 inhibitor group cells were lower than those inthe miR-NC group,NFIC mRNA and protein,E-cadherin levels were higher than those in the miR-NC group(P 5 cm 的癌旁组织作为对照。所有患者术前均未接受化疗或放疗,经病理诊断确诊为肺癌。组织样本置于液氮中,以备后续提取 RNA。本研究通过本院伦理审查委员会批准。1.1.3 试剂人肺癌 HCC827 细胞,上海生命科学研究所;胎牛血清和 RPMI-1640 培养基,浙江天杭生物科技有限公司;Lipofectamine 2000 转染试剂盒,美国 In-vitrogen 公司;miRNA 阴性对照(miRNA negative con-trol,miR-NC)、miR-550a-3 模拟物(miR-550a-3 mimics)、miR-550a-3 抑制物(miR-550a-3inhibitor),上海吉凯生物公司;Trizol,美国 Invitro-gen 公司;mRNA 反转录试剂盒和实时荧光 PCR(RT-PCR)试剂盒,宝生物工程(大连)有限公司。PCR引物序列由大连 TaKaRa 公司设计并合成:miR-550a-3 上游引物为 5-AGTGCCTGAGGGAGTAAG-3,下游引物为:5-GAACATGTCTGCGTATCTC-3;NFIC 上 游 引 物 为 5-TGGCGGCGATTACTA-CACTTCG-3,下游引物为:5-GGCTGTTGAATG-GTGACTTGTCC-3;U6 上游引物为 5-CCCCTG-GATCTTATCAGGCTC-3,下游引物为:5-GC-CATCTCCCCGGACAAAG-3。四 噻 唑 蓝(Methyltihiazolyl tetrazolium,MTT),美国 Amresco 公司;RIPA裂解液,上海生工生物工程有限公司;NFIC 抗体、E-钙粘蛋白(E-cadherin)抗体、N-钙粘蛋白(N-cadherin)抗体、-actin 抗体和 HRP 标记山羊抗鼠抗体,美国 Santa Cruz 公司。1.1.4 仪器CO2培养箱,美国 Ther-mo Revco 公司;Sunrise型全自动酶标仪,瑞士 Tecan 公司;基质胶和 24 孔Transwell 小室,美国 CORNING 科技有限公司;Real-time PCR 扩增仪和 BD 垂直电泳仪,美国 BD公司。1.2 方法1.2.1 细胞培养和转染用含 10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养基培养HCC827 细胞,37、5%CO2环境,隔天换液,选择对数生长期细胞进行实验。实验分为 miR-NC 组、miR-550a-3 mimics 组和 miR-550a-3 inhibitor组,按 Lipofectamine 2000 方法分别将 miR-NC、miR-550a-3 mimics 和 miR-550a-3inhibitor 转染到HCC827 细胞,48h 后进行相关检测。67 1 期胥杰,等:miR-550a-3 靶向 NFIC 表达调控肺癌细胞 HCC827 增殖、迁移和侵袭1.2.2RT-PCR 检测组织和细胞中 miR-550a-3、NFIC mRNA 表达 分别取组织标本及按 1.2.1 方法干预细胞,加入 Trizol 进行总 RNA 提取,将总 RNA 反转录为 cD-NA,制备 20 L 反应体系,在 Real-time PCR 扩增仪中进行扩增,采用 2-Ct法计算 miR-550a-3 和NFIC mRNA 的相对表达量(以 U6 作为内对照)。1.2.3 MTT 法检测细胞增殖率按照 1.2.1 方法干预细胞后接种于 96 孔板中(3 103/孔),48 h 后加入 MTT(20 L/孔),继续培养 4 h,离心弃上清,加入二甲基亚砜 200 mL,振荡10 min,用酶标仪测定吸光度值(Optical density,OD值),计算细胞增殖率(细胞增殖率=实验组 OD 值/miR-NC 组