阿司匹林乙酰化修饰HDAC...结肠癌细胞HCT116增殖_李梦云.pdf

文章编号：（）收稿日期：基金项目：国家自然科学基金（）作者简介：李梦云（），女，硕士研究生；余巍，男，教授，通信作者，：阿司匹林乙酰化修饰 抑制人结肠癌细胞 增殖李梦云，汤云兰，余巍（复旦大学 生命科学学院，上海 ）摘要：大量研究表明阿司匹林具有重要的抗肿瘤作用。阿司匹林的乙酰基可以乙酰化大量蛋白质，从而影响体内的乙酰化水平，但其乙酰化作用在抗肿瘤上的具体机制还不清楚。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（）已用于肿瘤治疗或处于临床研究，通过抑制组蛋白去乙酰化酶（，）的去乙酰化酶活发挥抗癌作用。组蛋白去乙酰化酶（，）是 依赖的类 家族成员，在多种癌症中表达上调，是组蛋白去乙酰化酶抑制剂（，）发挥抗癌作用最关键的靶点之一。在抗肿瘤的过程中，阿司匹林是否乙酰化调控 尚未见报道。在本文中，我们发现阿司匹林可以乙酰化 并抑制其去乙酰化酶活，赖氨酸（）位点是阿司匹林乙酰化 的关键位点。有趣的是，可以对自身去乙酰化，但不能发生在 上。沉默信息调节因子相关酶（），而不是 ，可以对 的 位点去乙酰化。进一步细胞学实验发现，在敲除 的人结肠癌 细胞中，阿司匹林不再抑制 细胞增殖，回补 的 突变体也无法恢复 细胞增殖，提示阿司匹林可能通过靶向 发挥抗 细胞增殖作用。关键词：阿司匹林；组蛋白去乙酰化酶；乙酰化；癌症中图分类号：文献标志码：阿司匹林（又名乙酰水杨酸）具有退热、镇痛、消炎和预防心血管疾病等疗效，而且价格低廉，因此在世界上被广泛使用。年，研究人员首次报道了阿司匹林与癌症的关系，从此开创了阿司匹林使用的新时代。此后，大量的流行病学和临床研究表明，长期服用阿司匹林可以显著降低癌症的发生率、生长、远处转移率和死亡率，而且阿司匹林降低结肠癌发生率比远端癌组织（乳房、肺、前列腺、肝脏和皮肤）更有效。体外研究显示，阿司匹林可以有效抑制多种癌细胞的增殖。此外，阿司匹林与其他抗癌药物的联合使用也是非常有前景的治疗方案。阿司匹林与环氧合酶（，）抑制剂联合使用可降低结肠癌的复发率和死亡率，阿司匹林联合免疫检查点阻断治疗可增强抗肿瘤免疫疗法的疗效。阿司匹林与组蛋白去乙酰化酶抑制剂（，）的联合使用可进一步诱导癌细胞死亡，然而这种协同抗癌作用的具体机制还不清楚。有研究表明，阿司匹林可能通过影响酶活性、转录因子、细胞信号和线粒体功能来发挥抗癌作用。目前，虽然阿司匹林发挥其抗癌作用的确切机制尚未阐明，但已经提出了 途径和非 途径。在 途径中，阿司匹林通过抑制 和 引起血小板相关功能障碍，从而抑制肿瘤生长。在非 通路中，阿司匹林可能通过抑制某些肿瘤转录因子、激活死亡受体、抑制 信号通路 、抑制 链断裂和减轻氧化应激 发挥抗癌作用。阿司匹林在体内会水解成乙酸盐和水杨酸盐。相比于其他药物，阿司匹林的乙酰基使其具有独特的作用方式，能乙酰化体内大量的蛋白质、脂质、和 ，从而影响体内的乙酰化稳态 。阿司匹林可以通过乙酰化修饰来发挥抗癌作用。目前研究比较深入的是，阿司匹林可以乙酰化 来降低其环氧合酶的能力，从而抑制癌细胞的增殖和血管生成。也有研究表明，阿司匹林可能通过乙酰化并激第 卷第期 年月复 旦 学 报（自然科学版）（）DOI:10.15943/ki.fdxb-jns.20220810.001活 突变体来抑制癌细胞的生长。然而，阿司匹林主要通过乙酰化哪些蛋白质来发挥抑癌作用尚不清楚，因此研究阿司匹林在肿瘤中乙酰化的底物和功能，将有助于阐明该药物抗癌作用的机制。本课题组发现，阿司匹林在体内可以直接乙酰化多数组蛋白去乙酰化酶（，）成员，且组蛋白去乙酰化酶（，）的乙酰化评分排在首位（未发表数据）。共有 个成员，都具有催化赖氨酸去乙酰化的功能。基于序列同源性，家族被分为类、类、类和类，是一种 依赖性的类 家族成员 。与酵母转录调节因子 具有高度同源性，揭示 是一种重要的转录调节因子。表达水平的改变会导致参与核酸代谢、脂质代谢、复制、细胞周期调节和信号转导的基因表达水平改变 。此外，大量研究表明 在胃癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、肝癌、肺癌 和乳腺癌 中都出现高表达。尤其是在胃肠癌中，的表达普遍上调，并且与肿瘤的去分化、增殖增强、侵袭、晚期疾病和预后不良有关。通过调控参与细胞周期、细胞凋亡、损伤应答、细胞迁移、血管生成和细胞自噬过程中的组蛋白和非组蛋白的乙酰化水平在癌症的发生发展过程中发挥重要作用 。由于在多种肿瘤的发生发展过程中，及其他 家族成员异常表达和活性异常，并且在肿瘤发展过程常常出现乙酰化状态的改变，因此很多 已经用于癌症治疗或处于临床试验阶段，主要通过抑制 的去乙酰化酶活发挥抗癌作用 。是一种重要的调控蛋白质乙酰化修饰的酶，其自身也存在广泛的翻译后修饰。在体内，酪蛋白激酶（）能磷酸化并增强 的去乙酰化酶活和转录抑制活性。在乳腺癌细胞中，能被 泛素化修饰降解，进而影响癌细胞的转移。有趣的是，作为一种典型的去乙酰化酶，其自身也能被乙酰化修饰。例如，能对 的赖氨酸进行乙酰化修饰，并且显著抑制 的去乙酰化酶活。在神经元细胞中，（）能对 去乙酰化，从而提高 的去乙酰化酶活，这对 双链断裂修复起到重要作用。除了常见的磷酸化、泛素化和乙酰化修饰外，还存在 化、亚硝基化和羰基化等翻译后修饰。因此可以看出，对 翻译后修饰的深入研究有利于全面理解 的功能和机制。在本研究中，我们发现阿司匹林在体内外乙酰化 并抑制其去乙酰化酶活，进一步发现 位点是阿司匹林乙酰化 的关键位点，该位点乙酰化能显着降低 的去乙酰化酶活。此外，作为一种去乙酰化酶，可以发生自我去乙酰化，但不能发生在 位点。，而不是 ，可以对 的 位点去乙酰化。有趣的是，阿司匹林还可以乙酰化 以抑制其去乙酰酶活（未发表数据），这意味着阿司匹林可以通过乙酰化调控 来增强对 的抑制作用，进一步发挥其抗癌作用。更重要的是，在 敲除的 （）细胞中，阿司匹林不再抑制 细胞增殖。进一步的研究发现，回补 可以促进 细胞增殖，但回补 的 （，谷氨酰胺，模 拟乙 酰化 修饰）突变 体并不能恢复 细胞增殖。上述研究结果表明，阿司匹林可能通过乙酰化 来抑制 细胞增殖，揭示了阿司匹林 潜在的抗肿瘤机制。材料与方法细胞培养人胚胎肾细胞 （）来自本实验室，人结肠癌细胞 来源于上海交通大学附属新华医院。上述细胞均培养在添加了 胎牛血清（）、青霉素和 链霉素（）的 高糖培养基中（），放于、的细胞培养箱中培养。质粒载体 和 为本实验室保存。质粒 、和 来自于复旦大学生命科学学院赵世民实验室，质粒由复旦大学生命科学学院王永明实验室馈赠，载体获赠于以色列的内盖夫本古里安大学 教授。其余质粒由本实验室构建，位点特异突变质粒使用 突变试剂盒（）构建。所有构建质粒在复 旦 学 报（自然科学版）第 卷使用前都要进行测序（擎科）验证。线性聚乙烯亚胺（）（）用于质粒转染。免疫共沉淀和免疫印迹用真空泵吸去细胞表面的培养基，再用磷酸盐缓冲液（）润洗细胞次，后加入 （）裂解液（），），放入冷室，水平摇晃 。收集细胞上清液，加入抗 或 亲和凝胶（），富集。用 裂解夜洗涤次，获得真核纯化的蛋白质，立即使用或 保存。若用于免疫印迹实验，需加入 蛋白上样缓冲液，变性 ，立即使用或 保存。本实验中使用聚丙烯酰胺浓度为 的 胶，上样后，先恒压，再恒压 ，。随后恒流 ，转膜。脱脂牛奶（）封闭阻断非特异性结合蛋白，用 脱脂牛奶稀释抗体，其孵育时间依据抗体说明书。实验中使用的一抗包括：抗 抗体（）、抗 抗体（）、抗乙酰化赖氨酸抗体（）、抗 抗体（）、抗 抗体（）和抗 抗体（）。真核表达位点特异乙酰化 为了实现 乙酰基赖氨酸在 中位点特异性插入，本实验室使用 突变试剂盒（）将 质粒中目的片段 的 、和 位点的密码子（、和）分别定向突变为，测序鉴定后，获得能在真核中表达 ，和 的质粒。将这些质粒分别转染到 细胞中，后将 乙酰基赖氨酸（）添加到培养基中。转染后 收获细胞用于后续实验。体外去乙酰化酶活检测真核纯化的重组 蛋白质与 底物（）（）加入去乙酰化反应溶液（），）中，反应。随后，加入 胰蛋白酶终止，反应，酶标仪（）检测 荧光强度。每个样本设置个重复。体外去乙酰化反应对于 自身去乙酰化，先把真核纯化的 蛋白与阿司匹林共孵育，获得乙酰化的 蛋白（），将其作为底物，并加入真核纯化的 蛋白（作为去乙酰化酶），在去乙酰化反应液中 孵育。在 对自身特异位点的去乙酰化实验中，以真核纯化的 蛋白和野生型 蛋白作为底物，加入真核纯化的 蛋白（作为去乙酰化酶），在 的去乙酰化反应溶液中孵育。在 去乙酰化 的实验中，以真核纯化的 蛋白和野生型 蛋白作为底物，分别加入 去乙酰化反应溶液（，（），），反应。敲除（）细胞系的构建运用 基因编辑技术在 细胞中稳定敲除 。靶向人类 的单链引导 （）序列在 （：）网站设计：；：。构建的 载体瞬时转染 细胞，转染 后，用嘌呤霉素筛选天，消化存活细胞，计数，稀释，铺单个细胞到 孔板中。单个细胞扩增成群落后，消化，扩增培养，并用免疫印迹法检验 的敲除效果。稳定细胞系构建以 质粒为模板，采用同源重组的方法构建 逆转录病毒载体。利用 突变试剂盒（）将该载体上目的基因 第 位的赖氨酸（）突变为谷氨酰胺。将构建的 质粒同病毒包装质粒 和 按 的比例瞬时转染第期李梦云等：阿司匹林乙酰化修饰 抑制人结肠癌细胞 增殖 细胞，后，取病毒上清感染 细胞，用 潮霉素筛选一周，用免疫印迹检测目的基因的表达情况。细胞增殖实验待检测细胞用胰酶（）消化，培养基重悬，计数，稀释，按每孔 培养基 个细胞的标准接种到 孔板中，每组个重复。细胞贴壁后，每孔加入 试剂（），在，细胞培养箱中孵育。用酶标仪（）检测 处的吸光值。在同一时间点，连续检测天。数据统计分析实验数据用 、进行分析，这些分析结果以平均值标准差（）表示。两组数据差异分析均采用双尾检验，当 时，认为差异有意义。结果阿司匹林乙酰化修饰 并抑制其去乙酰化酶活在 细胞中过表达带标签的 （），裂解细胞取上清，用抗亲和凝胶进行免疫沉淀，富集的 蛋白与不同浓度的阿司匹林（，）在体外 孵育，通过免疫印迹检测 的乙酰化水平，并将与阿司匹林孵育后的 与 反应进行去乙酰化酶活检测。结果显示，在体外随着阿司匹林浓度升高，的乙酰化水平逐渐增加（图（），并且 的去乙酰化酶活也逐渐降低（图（）。因此，确定阿司匹林可以在体外乙酰化 并抑制 的去乙酰化酶活。为了进一步探索阿司匹林在体内能否乙酰化修饰 ，我们首先在 细胞中过表达 蛋白，用不同浓度的阿司匹林（，）处理细胞，免疫沉淀获得 蛋白，检测 蛋白的乙酰化水平和 去乙酰化酶活。在 细胞中，随着阿司匹林浓度升高，的乙酰化水平也呈现梯度式上升（图（），而且 的去乙酰化酶活也逐渐降低（图（）。因此，在 细胞中，阿司匹林也能直接乙酰化 ，并且显著抑制 的去乙酰化酶活。紧接着，我们分别用不同浓度的阿司匹林处理过表达 蛋白的 细胞，后，通过免疫沉淀技术获得 蛋白，随后检测 上的乙酰化水平和 去乙酰化酶活。实验结果显示，细胞中的 会被阿司匹林乙酰化修饰，并且乙酰化修饰程度与阿司匹林浓度呈正相关（图（）。此外，的去乙酰化酶活也会随着阿司匹林浓度的增加而显著降低（图（）。因此，在 细胞中，阿司匹林可以乙酰化修饰 并且抑制其去乙酰化酶活。位点是阿司匹林乙酰化 的关键位点为了检测阿司匹林乙酰化 的位点，用 同位素氘（）标记乙酰基的阿司匹林处理过表达 的 细胞，质朴检测 蛋白的乙酰基修饰（图，见第 页）。发现阿司匹林可以乙酰化修饰 的 、和 位点（图（），这些可以被阿司匹林乙酰化修饰的赖氨酸占 中总赖氨酸的 （图（）。为了确定阿司匹林乙酰化 的功能位点，我们分别将质谱鉴定到的赖氨酸（）位点突变为（精氨酸，模拟赖氨酸去乙酰化状态）和谷氨酰胺（，模拟赖氨酸乙酰化修饰状态），并将这些 突变体的去乙酰化酶活与野生型 比较。结果表明，只有 、和 显着降低 的去乙酰化酶活（图（）。尽管谷氨酰胺可以模拟乙酰化修饰的赖氨酸，并对蛋白质乙酰化的功能影响提供可能的解释，但这种策略并不能揭示乙酰化的真正结果。因此，为了进一步验证上述结果，我们利用位点特异插入 技 术 将 乙 酰 基赖 氨 酸 位 点