第33卷第1期2023年2月生物技术Biotechnology33(1):1Feb.,2023收稿日期:2022-04-15基金资助:国家自然科学基金项目(82071527)作者简介:郭励劼(1998-),男,山东省济南人,本科,研究方向:m6A在抑郁发生中作用及机制,E-mail:guolijie1998@sina.com。∗通讯作者:杨予涛(1972-),男,博士,副教授,研究方向:神经生物学,发表SCI论文30余篇,获专利授权1项,E-mail:yutaoy@ccmu.edu.cn。论著RESEARCHPAPERm6A去甲基化酶ALKBH5对大鼠S1PR3基因3′-非编码区双荧光素酶活性的影响郭励劼,王泌林,李琛琛,许婧怡,徐志卿,杨予涛∗(首都医科大学基础医学院,北京100069)摘要:[目的]明确m6A去甲基化酶ALKBH5对含S1PR3基因3′-非编码区(3′-UTR)双荧光素酶报告基因的调控作用。[方法]以大鼠前额叶皮层脑区cDNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增S1PR3基因3′-UTR中含有m6A修饰位点的目的片段。利用重叠延伸PCR方法将三个靶序列GGACT、GGACT、AGACT中的第三位A突变为C,并将野生型S1PR3-3′-UTR片段和突变型S1PR3-mut-3′-UTR片段分别正向插入到pmiR-RB-ReportTMvector载体中。将pcDNA3.1-ALKBH5或空载体pcDNA3.1与野生型和突变型双荧光素酶报告载体分别共转染PC12细胞,并检测荧光素酶活性。[结果]成功构建了包含S1PR3基因3′-UTR野生型双荧光素酶报告载体pmiR-S1PR3-3′-UTR和突变型双荧光素酶报告载体pmiR-S1PR3-mut-3′-UTR。荧光素酶活性分析表明与空载体pcDNA3.1组相比,ALKBH5可显著降低野生型及突变型C1和C2报告载体荧光素酶的活性(P<0.05),而对突变型C3没有影响(P>0.05)。[结论]初步证明S1PR3基因3′-UTR区是去甲基化酶ALKBH5的作用靶点,ALKBH5通过识别S1PR3基因3′-UTR区C3处的m6A修饰位点而降低pmiR-S1PR3-3′-UTR荧光素酶的活性。关键词:m6A;1-磷酸鞘氨醇受体3;抑郁症;pmiR-S1PR3-3′-UTR;双荧光素酶活性检测中图分类号:R749文献标识码:ADOI:10.16519/j.cnki.1004-311x.2023.01.0001Effectofm6AdemethylaseALKBH5ontheactivityof3′-untranslatedregionsofratS1PR3genedual-luciferaseGUOLi-jie,WANGMi-lin,LIChen-chen,XUJing-yi,XUZhi-qing,YANGYu-tao∗(SchoolofBasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)Abstract:[Objective]Toexploretheeffectofm6AdemethylaseALKBH5ontheactivityof3′-UTRofratS1PR3reportergene.[Method]The3′-UTRofratS1PR3genewasamplifiedbypolymerasechainreaction(PCR).ThreetargetsequencesGGACT,GGACT,AGA...
