m-6A去甲基化酶ALKB...编码区双荧光素酶活性的影响_郭励劼.pdf

第 33 卷第 1 期2023 年 2 月生物技术Biotechnology33(1):1Feb.,2023 收稿日期:2022-04-15 基金资助:国家自然科学基金项目(82071527)作者简介:郭励劼(1998-),男,山东省济南人,本科,研究方向:m6A 在抑郁发生中作用及机制,E-mail:guolijie1998 。通讯作者:杨予涛(1972-),男,博士,副教授,研究方向:神经生物学,发表 SCI 论文 30 余篇,获专利授权 1 项,E-mail:yutaoy 。论 著RESEARCH PAPERm6A 去甲基化酶 ALKBH5 对大鼠 S1PR3 基因 3-非编码区双荧光素酶活性的影响郭励劼,王泌林,李琛琛,许婧怡,徐志卿,杨予涛(首都医科大学基础医学院,北京 100069)摘要:目的 明确 m6A 去甲基化酶 ALKBH5 对含 S1PR3 基因 3-非编码区(3-UTR)双荧光素酶报告基因的调控作用。方法 以大鼠前额叶皮层脑区 cDNA 为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增 S1PR3 基因 3-UTR 中含有m6A 修饰位点的目的片段。利用重叠延伸 PCR 方法将三个靶序列 GGACT、GGACT、AGACT 中的第三位 A 突变为 C,并将野生型 S1PR3-3-UTR 片段和突变型 S1PR3-mut-3-UTR 片段分别正向插入到 pmiR-RB-ReportTMvector载体中。将 pcDNA3.1-ALKBH5 或空载体 pcDNA3.1 与野生型和突变型双荧光素酶报告载体分别共转染 PC12 细胞,并检测荧光素酶活性。结果 成功构建了包含 S1PR3 基因3-UTR 野生型双荧光素酶报告载体 pmiR-S1PR3-3-UTR 和突变型双荧光素酶报告载体 pmiR-S1PR3-mut-3-UTR。荧光素酶活性分析表明与空载体 pcDNA3.1组相比,ALKBH5 可显著降低野生型及突变型 C1 和 C2 报告载体荧光素酶的活性(P 0.05)。结论 初步证明 S1PR3 基因 3-UTR 区是去甲基化酶 ALKBH5 的作用靶点,ALKBH5 通过识别S1PR3 基因 3-UTR 区 C3 处的 m6A 修饰位点而降低 pmiR-S1PR3-3-UTR 荧光素酶的活性。关键词:m6A;1-磷酸鞘氨醇受体 3;抑郁症;pmiR-S1PR3-3-UTR;双荧光素酶活性检测中图分类号:R749 文献标识码:A DOI:10.16519/ki.1004-311x.2023.01.0001Effect of m6A demethylase ALKBH5 on the activity of 3-untranslatedregions of rat S1PR3 gene dual-luciferaseGUO Li-jie,WANG Mi-lin,LI Chen-chen,XU Jing-yi,XU Zhi-qing,YANG Yu-tao(School of Basic Medical Sciences,Capital Medical University,Beijing 100069,China)Abstract:ObjectiveTo explore the effect of m6A demethylase ALKBH5 on the activity of 3-UTR of rat S1PR3 reportergene.Method The 3-UTR of rat S1PR3 gene was amplified by polymerase chain reaction(PCR).Three target sequencesGGACT,GGACT,AGACT were mutated into GGCCT,GGCCT,AGCCT by overlap extension PCR.Then,S1PR3-3-UTR andS1PR3 mut-3-UTR were inserted into pmiR-RB-ReportTMvector,respectively.The pcDNA3.1-ALKBH5 or its controlvector pcDNA3.1 was co-transfected with wild type or mutant reporter vectors into PC12 cells and luciferase activities weremeasured.Result The wild type pmiR-S1PR3-3-UTR vector and the mutant pmiR-S1PR3-mut 3-UTR vector weresuccessfully constructed.Luciferase activities demonstrated that pcDNA3.1-ALKBH5 decreased the activity of wild type re-porter vector or mutant C1,C2 reporter vector(P 0.05).Conclusion The rat S1PR3 gene 3-UTR is a potential target of m6A demethylase ALKBH5.ALKBH5 decreases the activityof pmiR-S1PR3-3-UTR by recognizing the m6A site at C3 in the 3-UTR region of the S1PR3 gene.Keywords:m6A;sphingosine 1-phosphate receptor 3;major depressive disorder;pmiR-S1PR3-3-UTR;dual-lucif-erase activity 抑郁症是一种持续出现快感缺失、绝望无助和情绪低落为主要临床症状的精神类疾病1。全球已有超 3.5 亿的抑郁症患者,具有高发病率、高致残率和高自杀风险的特点,给患者、家庭和社会造成沉重的负担2。因此,抑郁症已成为严重影响社会经济发展,迫切需要解决的公共卫生问题,深入探讨抑郁生 物 技 术2023 年症的发病机制具有重要的理论和现实意义。m6A 是真核细胞中 RNA 最丰富的修饰方式,在转录后水平调控基因的表达3。m6A 修饰由三种核心组分甲基转移酶复合物 METTL3(methyltransferase-like 3)、METTL14(methyltransferase-like 14)、WTAP(Wilms tumor 1 associated protein)来催化。RNA 去甲基化则由两种去甲基酶 FTO(fat mass andobesity-associated protein)和 ALKBH5(alkB homo-log 5)来 执 行3。研 究 表 明,m6A 主 要 出 现 在DRACH(即AGUAGACACU)基序上。m6A在脑组织中表达丰度较高,当 m6A 修饰及其调节蛋白的水平发生异常,将导致脑组织发育缓慢和轴突再生能力减弱,进而引起神经系统功能的改变4。RNA 去甲基化酶 ALKBH5 在小鼠大脑中广泛分布,在小鼠的小脑和嗅球等部位表达较高。随着小鼠大脑发育,ALKBH5 的表达明显降低5。对中国汉族 738 个抑郁症患者与1 098个对照受试者中的 23 个单核苷酸多态性进行了分析,发现 ALKBH5的多态性与抑郁症的发生有很强的相关性6。在星形胶质细胞中过表达环状 RNA STAG1 可抑制 ALK-BH5 由胞质向胞核转运,导致 FAAH 基因 mRNA 的m6A 修饰水平的下降,促进了 FAAH 的降解,从而改善星形胶质细胞的功能,最终减轻抑郁样行为发生7。S1PR3 受体是 1-磷酸鞘氨醇的主要受体之一,调节多种生理和病理过程8-9。研究发现大鼠内侧前额叶皮层(mPFC)中的 S1PR3 可以调节慢性社交应激挫败大鼠的抑郁易感性。与应激易感和对照大鼠相比,应激抵抗大鼠 mPFC 中 S1PR3 表达明显升高。通过慢病毒在 mPFC 中敲低 S1PR3 的表达将导致正常大鼠产生抑郁样行为,而过表达 S1PR3可改善大鼠的抑郁样行为10。尽管人们对 S1PR3在抑郁发生中的作用有了一定了解,但 S1PR3 基因是否存在 m6A 修饰的位点,ALKBH5 能否通过影响S1PR3 基因的 m6A 修饰而调节 S1PR3 基因的表达至今仍未见报道。基于上述原因,笔者首先利用 SRAMP m6A 在线预测网站预测大鼠 S1PR3 基因的 3-UTR 区是否存在 m6A 修饰位点。然后,以大鼠 S1PR3 基因 3-UTR 区为研究对象,将 S1PR3 基因 3-UTR 克隆到pmiR-RB-ReportTM载体中。同时,将 S1PR3 基因3-UTR 中 m6A 修饰位点进行突变,构建含有S1PR3 基因 3-UTR 突变型的双荧光素酶报告载体。通过双荧光素酶活性检测系统分析 m6A 去甲基化酶 ALKBH5 对野生型及突变型 S1PR3 基因3-UTR双荧光素酶活性的影响。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验材料双荧光素酶报告载体 pmiR-RB-ReportTMvec-tor,广州锐博生物科技有限公司。大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)株为笔者实验室保藏株。大肠杆菌(E.coli)DH5 菌株,南京诺唯赞生物科技股份有限公司。1.1.2 试剂双荧光素酶报告基因检测试剂盒、胶回收试剂盒:山东思科捷生物技术有限公司;单链 cDNA 反转录合成试剂盒:上海罗氏制药有限公司;2 TaqPCR Master mix、DNA marker/:北京天根生化科技有限公司;Prime Star DNA 聚合酶、5 PrimeStar Buffer、dNTPs,日 本 Takara;EcoR 内 切 酶、Not内切酶、Xho内切酶、Hind内切酶、T4 DNA连接酶、10 DNA Ligase Reaction Buffer、电泳核酸染料(6 ),美国 NEB;氨苄青霉素,美国 Sigma。胎牛血清、马血清,美国 Gibco。质粒提取试剂盒,美国OMEGA;0.25%胰酶、LipofectamineTM3000 Regent 转染试剂盒,美国 Invitrogen;胰蛋白胨、酵母粉、琼脂粉,美国 USB。1.1.3 仪器Luminoskan 微 孔 板 读 数 仪 H5300332,美 国ThermoFisher;Nano Drop 2000 紫外分光光度计 ND-LITE-PR,美国 Thermo;聚合酶链式反应(polymer-ase chain reaction,PCR)仪 CFX96,美国 BIORAD;Al-pha Image 凝胶成像系统 BJ001285,美国 HP。B6060细菌培养箱,德国 Heraeus;PYY-7C 恒压恒流电泳仪,北京六一仪器厂。1.1.4 培养基Hams F-12K(Kaighns)培养基,减血清培养基 Opti-MEMI,美国 Invitrogen 公司。PC12 细胞在含有 15%马血清、2.5%胎牛血清的 Hams F-12K(Kaighns)培养基中进行培养,当细胞生长到对数期后进行后续实验。1.2 方法1.2.1 大鼠 S1PR3 基因 m6A 作用靶点预测通过 GenBank 查找大鼠 S1PR3 基因的3-UTR2 1 期郭励劼,等:m6A 去甲基化酶 ALKBH5 对大鼠 S1PR3 基因 3-非编码区双荧光素酶活性的影响序列。利用 m6A 预测网站 SRAMP( S1PR3 基因 3-UTR 的 m6A 位点。1.2.2 大鼠 cDNA 的提取以及 PCR 扩增随机挑选一只成年正常 SD 大鼠,用 6%水合氯醛麻醉后,取其新鲜前额叶皮层脑(mPFC)组织,利用 Tri