NLRP3_IL-1β_T...心肌纤维化小鼠中的作用研究_刘孟楠.pdf

中国循证心血管医学杂志2022年11月第14卷第11期 Chin J Evid Based Cardiovasc Med,November,2022,Vol.14,No.11 1320 论著 NLRP3/IL-1/TGF-1信号轴在Ang诱导高血压心肌纤维化小鼠中的作用研究刘孟楠1,2，杨廷富1，罗钢1，刘颜1，杨思进1,2基金项目：国家自然科学基金面上项目(82074378);四川省中医药管理局项目(2021MS097);西南医科大学青年项目(2021ZKQN143);广东省中医药局面上项目(20221354);深圳市自然科学基金面上项目(JCYJ20210324111213038);广东省自然科学基金面上项目(2022A1515011647)【摘要】目的 探讨NLRP3/IL-1/TGF-1信号轴在血管紧张素（Ang）诱导高血压心肌纤维化小鼠中的作用。方法 30只雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组、模型组和福辛普利组。建立高血压心肌纤维化模型后，福辛普利组予以福辛普利钠1.2 mg/kgd灌胃。造模后每周检测收缩压1次；采用超声心动图检测各组小鼠心脏功能指标，包括左室舒张末期内径（LVEDd）、左室收缩末期内径（LVESd）、左心室射血分数（LVEF）和左心室缩短分数（LVFS）；采用HE染色和马松染色检测小鼠心肌组织病变情况；采用RT-PCR法测定小鼠心脏NLRP3、IL-1及TGF-1 mRNA的表达情况；Western blot法测定小鼠心脏NLRP3、Caspase-1、IL-1及TGF-1蛋白的表达情况。结果 模型组较对照组收缩压明显升高（P0.05），与模型组比较，福辛普利组收缩压明显降低（P0.05）；HE及马松染色显示，对照组小鼠心肌间心肌细胞结构形态正常，排列整齐，心肌间质间几乎无蓝色胶原纤维分布，心血管形态正常；模型组小鼠心肌细胞肥大、排列紊乱，部分细胞肿胀变形、溶解，心肌间质及血管周围可见大量蓝色胶原纤维，福辛普利组可见小鼠心肌细胞排列紊乱明显改善，心肌间质蓝染的胶原纤维显著减少，心肌及血管周围的纤维化损伤均得到有效改善。RT-PCR结果显示模型组较对照组NLRP3，IL-1及TGF-1 mRNA表达均显著上升（P0.01），与模型组比较，福辛普利组以上指标均显著下降（P0.01）；与对照组比较，模型组NLRP3、Caspase-1、IL-1及TGF-1蛋白表达均显著上升（P0.01），与模型组比较，福辛普利组NLRP3、Caspase-1、IL-1及TGF-1均显著下降（P0.05）。结论 NLRP3/IL-1/TGF-1信号轴与高血压心肌纤维化密切相关，血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）类药物可控制血压并减轻心肌纤维化。【关键词】NLRP3；白介素-1；转化生长因子-；高血压心肌纤维化；血管紧张素转化酶抑制剂；小鼠【中图分类号】R541.3 【文献标志码】A 开放科学（源服务）标识码（OSID）Effect of NLRP3/IL-1/TGF-1 signal axis on angiotensin-induced hypertensive myocardial fibrosis in mice Liu Mengnan*,Yang Tingfu,Luo Gang,Liu Yan,Yang Sijin.*Department of Cardiovascular Medicine,Hospital of Traditional Chinese Medicine,Southwest Medical University,Luzhou 646000,China.Corresponding author:Yang Sijin,E-mail:Abstract Objective To study the effect of NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3/interleukin-1/transforming growth factor 1(NLRP3/IL-1/TGF-1)signal axis on angiotensin (Ang)-induced hypertensive myocardial fibrosis in mice.Methods Male C57BL/6J mice(n=30)were randomly divided into control group,model group and fosinopril group.After established the model of hypertensive myocardial fibrosis,fosinopril group was orally given fosinopril(1.2 mg/kg/day).The level of systolic blood pressure(SBP)was detected once a week in all groups after modeling.The indexes of heart function were detected by using echocardiogram,including left ventricular end-diastolic inner diameter(LVEDd),left ventricular end-systolic diameter(LVESd),left ventricular ejection fraction(LVEF)and left ventricular fraction shortening(LVFS).The lesions of myocardial tissue were detected by using HE staining and Masson staining.The mRNA expressions of NLRP3,IL-1 and TGF-1 were detected by using RT-PCR.The protein expressions of NLRP3,Caspase-1,IL-1 and TGF-1 were detected by using Western blotting assay.Results SBP increased significantly in model group compared with control group(P0.05),and decreased significantly in fosinopril group compared with model group(P0.05).The results of HE staining and Masson staining showed that the structure and morphology of cardiomyocytes were normal,arranged neatly,there was less blue collagen fiber distribution,and cardiovascular morphology was normal in control group,cardiomyocytes were hypertrophy and disordered,some cardiomyocytes 作者单位：1 646000 泸州,西南医科大学附属中医医院心血管内科;2 999078 澳门,澳门科技大学中医药学院通讯作者：杨思进,E-mail:doi：10.3969/j.issn.1674-4055.2022.11.08 1321 中国循证心血管医学杂志2022年11月第14卷第11期 Chin J Evid Based Cardiovasc Med,November,2022,Vol.14,No.11高血压是指流动的血液对血管壁的压力值持续高于正常。20122015年流行病学调查显示我国成人高血压患病率为27.9%，且有持续上升的趋势1,2。高血压是常见的慢性疾病，常伴循环系统的靶器官损伤，持续的血压增高会导致心肌纤维化，严重影响心脏的收缩和舒张功能2。肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）为体内肾脏所产生的一种升压调节体系，该系统的激活会导致血管紧张素（Ang）在体内的分泌增高致使血管收缩，血压增高。抑制RAAS系统的激活及拮抗Ang是治疗高血压心肌纤维化的重要途径3。有研究表明与转化生长因子-（TGF-）有关的多条信号通路的激活与多种器官纤维化密切相关4；核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体所介导的细胞焦亡被认为是一种新型的细胞程序性死亡方式，其下游炎症因子白介素-1（IL-1）可在局部甚至全身引起广泛炎症，亦有研究表明，NLRP3炎症小体在各种器官纤维化过程中起重要作用5,6。本研究拟探讨NLRP3/IL-1/TGF-1信号轴在Ang诱导高血压心肌纤维化小鼠中的作用，借此说明该信号轴之间的内部联系并为高血压心肌纤维化的治疗提供靶点依据。1 材料及方法1.1 主要实验材料 福辛普利钠片购自中美上海施贵宝制药有限公司，国药准字：H19980197；Ang购自美国Sigma公司，货号：A9525-50MG；Alzet渗透压泵购自美国Alzet公司，型号：Model2004；NLRP3、Caspase-1、IL-1、TGF-1和GAPDH抗体均购自美国Affinity公司，货号分别为DF7438、AF5418、AF4006、BF8012、AF7021；化学发光成像系统，上海勤翔科学仪器有限公司，型号：ChemiScope 6200；荧光定量PCR仪，瑞士ROche公司，型号：LightCycler 480；尾套管无创血压仪，日本软隆株式会社，型号：BP98A；超高分辨小动物超声成像机，加拿大FUJIFILM VisualSonics公司，型号：Vevo 3100。1.2 模型建立及分组 SPF级雄性C57BL/6J小鼠30只，体重1921 g，动物可证号：SCXK（京）2019-0010。饲养在西南医科大学动物实验中心，随机分为对照组、模型组和福辛普利组。模型组和福辛普利组均以背部皮下植入剂量为1.46 mg/kgd的渗透压泵持续输注Ang 连续28 d的方式建立高血压心肌纤维化模型，福辛普利组予以福辛普利钠1.2 mg/kgd灌胃。各组均普食，不限饮水。造模后每周第5 d上午8时使用鼠尾套管无创血压仪检测血压1次，收缩压持续高于150 mmHg（1 mmHg=0.133kPa）表明造模有效，造模结束后处死小鼠取心脏行马松染色，可见明显胶原增生及血管周围纤维化则造模成功。以上研究方案均通过西南医科大学实验动物福利伦理审查，伦理审批编号：20200812。1.3 检测指标及方法1.3.1 血压监测 采用尾套法监测收缩压（SBP），测量前将大鼠在35 下保温5 min，重复测量3次。1.3.2 超声心动图 造模第28 d，小鼠经2%异氟烷麻醉后剃毛后进行超声心动图评估心脏功能。指标包括左室舒张末期内径（LVEDd）、左室收缩末期内径（LVESd）、左心室射血分数（LVEF）和左心室缩短分数（LVFS）。1.3.3 组织学和免疫组织化学 心脏标本用4%多聚甲醛固定24 h，次日石蜡包埋、切片，进行苏木精和伊红（HE）染色和马松（Masson）染色，完成后进行形态学观察。1.3.4 RT-PCR 使用Trizol法从心脏组织中提取总RNA。DNase处理后，将RNA逆转录为cDNA，扩增后使用荧光定量PCR仪进行常规溶解曲线分析测定Ct值，以2-Ct的计算值作为相对表达水平，GAPDH用作内参进行对照。实验所需引物由上海生工公司合成（表1）。1.3.5 Western blot检测 将心脏组织在RIPA裂were swollen,defor