MPT64在结核患者外周血相关表达水平研究_黄震.pdf

李佳，任文娟，高春燕，等小儿肠绞痛和肠道菌群组成与免疫标志物相关分析贵州医药，（）：何妙玲，高碧环，赵卫中药穴位敷贴联合摩腹治疗婴儿肠绞痛腹部中寒型 例临床观察中医儿科杂志，（）：李柳韶，张子才温中健脾穴位贴联合小儿康颗粒在婴儿肠绞痛中的应用效果医疗装备，（）：王小敏，徐鹏，王俣棋，等慢性炎性疼痛对小鼠肠道菌群的影响安徽医科大学学报，（）：傅书山，朱磊，王琼，等清肠化湿方对溃疡性结肠炎湿热证小鼠 蛋白及相关炎症因子表达的影响中国中西医结合杂志，（）：田莲莲，林燕，郭世博，等炎症性肠病小鼠不同进展时期肠道巨噬细胞的亚群变化中华实用儿科临床杂志，（）：方莹，孙丽娜，韩亚楠，等炎症性肠病患儿血清 相关细胞因子表达及其意义中国实用儿科杂志，（）：（收稿日期：）在结核患者外周血相关表达水平研究黄震 曾健 孙俊生 陈思达【摘要】目的 探讨肺结核患者（）患者外周血 的相关表达水平的意义。方法选择 年 月 年 月在本院诊断为活动性肺结核的患者 例作为研究对象，并设为 患者组，再细分为活动期组和稳定期组两组，每组各 例；以同期健康体检者 名为对照组。分离外周血中的血清和单个核细胞（），用实时荧光定量 检测 中 的表达水平；同时用 法检测血清中 的水平、全血 干扰素诱导蛋白（）和白介素（）水平，并对、及 进行比较分析。结果 患者 中 表达水平高于对照组（），活动期患者 中 表达水平显著高于稳定期患者的表达水平（）。患者血清中 的水平高于对照组（），活动期患者血清中 水平又显著高于稳定期患者（）。患者血清中 的水平与 及 成正相关（、，）。结论 血清、及 水平呈现与活动性肺结核病情相关的动态变化，可作为活动性结核病的辅助诊断方法。【关键词】结核；中图分类号 文献标识码：，；，：，：【】（），（），（）（），（）（）（），（）（，），【】；基金项目：深圳市龙岗区经济与科技发展专项资金 医疗卫生科技计划（）作者单位：广东深圳，龙岗中心医院 临床医学院办公室（黄震），麻醉科（曾健），呼吸科（孙俊生、陈思达）通信作者：黄震，：齐齐哈尔医学院学报 年第 卷第 期 ，结核病（，）是世界上引起死亡的最严重的感染性疾病，威胁着全世界人们的健康和生命；近年来，由于耐药 株的出现，这个全球性的公共卫生问题的严重性日益加重。早期发现和早期诊断结核病患者，给予有效的治疗，是减少传播机会、控制结核病疫情的关键环节。为了进一步提高结核病的诊断、治疗和预防控制水平，现在迫切需要更为精确快速的诊断新技术用于临床标本。肺结核的发病机制尚不明确。目前多认为结核菌可诱导体内 细胞因子平衡变化，向利于结核菌逃逸细胞免疫的方向发展，从而导致肺结核发病。检测可以用于分枝杆菌培养物的确认，通过检测培养滤液中的 可鉴别（结核病）和（非结核病），最终达到诊断结核病的目的。众多研究提示：和 诱导蛋白（）在结核患者中的高表达与结核病的发生发展密切的关系，和 可用于结核病诊断的新的生物标记物。是细胞免疫重要的激活剂，能增强结核病患者吞噬细胞吞噬能力和 细胞杀伤活性，有效提高机体抵御 感染的细胞免疫功能。本研究通过检测 的 中的 的表达，应用结核分枝杆菌特异性蛋白早期分泌性靶抗原（）和培养液蛋白（）体外刺激后，对 例 结 核 病 住 院 患 者 及 对 照 组 进 行、及 血清学检测，并对其在活动性肺结核病情相关的动态变化进行比较分析，旨在评价 蛋白在结核病血清学诊断中的价值及治疗效果评价、预后等提供帮助。一、资料与方法一般资料：选择 年 月 年 月在本院诊断为活动性肺结核的患者 例作为研究对象，并设为 患者组，平均（）岁，诊断标准符合肺结核诊断和治疗指南：（）有结核中毒症状；（）肺部影像学显示活动性肺结核；（）痰检抗酸杆菌阳性。所有患者均为单一结核病感染，无合并糖尿病、肝炎、肾炎、感染及其他免疫性疾病，未使用免疫调节剂。以上 例患者均给予卫生部推荐化疗方案（异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇 个月强化期以及异烟肼、利福平 个月巩固期）治疗，治疗后所有患者临床症状缓解，痰涂片呈阴性。治疗前后采集外周血样本。另外，选择同期健康体检者 名作为对照组，平均（岁）。对照组纳入标准：（）未接触结核病患者；（）肺部影像学检查正常；（）血常规正常；（）菌素皮肤实验结果阴性。两组一般资料比较，差异无统计学意义（）。所有参与对象均签署了知情同意书，并得到本院伦理委员会的批准。仪器：、蛋白购于北京热景生物有限公司，细胞培养液 培养基购于北京公司，实时荧光定量 购自宝生物公司，及 试剂盒购于美国 公司，试剂盒购自武汉华美生物公司。酶标检测仪购于深圳雷杜公司。方法：（）实时荧光定量 检测：提取 患者外周血单个核细胞，采用 法提取总。按宝生物 试剂盒说明进行 合 成。基 因 特 异 性 引 物（根 据 登录号 的 的基因序列设计）及看家基因甘油醛磷酸脱氢酶（）引物均由广州英骏公司合成，引物序列见表。采用 实时荧光定量检测技术相对法进行目的基因的检测，按照宝生物公司 试剂盒说明在 型荧光定量 扩增仪（美国 公司）进行定量检测。管家基因甘油醛磷酸脱氢酶（）引物参考文献设计。（）检测 血清、及 水平：采集患者清晨空腹静脉血 。离心后取上清，置于 保存待测。全部标本一次性检测。、及操作严格按照说明书进行。统计学处理：采用 软件进行统计学分析，图表数据以均数标准差（）表示，统计学方法采用单因素方差分析。表示差异有统计学意义。二、结果 患者 中 的表达检测结果：以对照组细胞作为空白组样品，计算出各个实验组样品相对于空白组样品的基因相对表达量，即检测基因的差异（处理样品未处理样品）。从上述实验中发现，活动期 患者组 的相对表达量上升了 倍，表 引物序列基因引 物扩增片段（）上游引物 下游引物 上游引物 下游引物 齐齐哈尔医学院学报 年第 卷第 期 ，与对照组比较具有统计学差异（），稳定期 患者组 的相对表达量上升了 倍，与对照组比较具有统计学差异（）。而活动期 患者组 相对表达量与稳定期 患者组比较具有统计学差异（）。见图。注：为活动期组与对照组比较，为稳定期组与对照组比较，为活动期组与稳定期组比较图 不同组别 患者 相对表达量 血清中 检测结果：根据直线回归方程式代入各样本吸光度值，计算出所有样本的 浓度，结果显示，患者血清 含量为（），明显高于对照组的（），差异有统计学意义（）（图）。通过临床资料分析，进一步将 患者分为活动期组与稳定期组，结果显示，与稳定期 患者的（）相比，活动期 患者血清 的含量（）明显增高，差异有统计学意义（）（图）。图 患者组血清 水平与健康对照组比较 对 患者血清 与、水平进行相关性分析：结果显示，患者血清 水 平 与 、含 量 成 正 相 关（）。见表。图 患者活动期组与稳定期组血清 水平比较表 患者血清 水平与 及 抗体相关性分析指标（）值 值 讨论 感染时，体内免疫细胞产生的各种细胞因子处于精密的调节中，构成了细胞因子网络，各细胞因子之间也相互调节，通过各种机制来发挥免疫调节作用。有学者在体外实验有很多资料研究了 和、和、和 等之间相互诱导、相互抑制、相互调节的关系。是 生长过程中分泌最多的蛋白之一，有研究者应用质谱技术对肺结核患者血清外泌体中的蛋白质肽类进行了分析，发现外泌体中包含二十种能用于 检测的蛋白质，其中就包括、等 分泌蛋白。国内研究人员应用自建的 方法检测肺结核患者血液中，其阳性率可达 ，明显高于、等其它分泌蛋白。等应用双抗体夹心法检测肺结核患者血液中，在最低检出浓度为 的情况下，其阳性率可达，明显高于、等其它分泌蛋白。趋化因子，属于 趋化因子家族，主要由记忆 淋巴细胞和被激活的 淋巴细胞及 细胞表达，在静止的 细胞和 细胞及单核细胞和粒细胞没有表达。国内学者研究发现活动性结核患者血浆中 的表达显著高于稳定期结核患者和健康对照，提示 在结核患者中的高表达与结核病的发生发展密切的关系。等研究发现，及其相应的受体在结核患者中的表达显著高于非结核患者，并且在胸腔积液中的表达显齐齐哈尔医学院学报 年第 卷第 期 ，著的高于外周血。这也提示 及其他趋化因子在结核感染部位富集，有助于诱导有效的 细胞免疫反应，有利于结核菌的清除。是一种具有广泛生物活性的细胞因子，主要由激活的炎性细胞所产生，具有广泛的抗炎性细胞因子。研究表明，主要作用于淋巴细胞，是 细胞免疫应答的决定性驱动因素。可促进 类细胞因子 的合成和分泌，同时可抑制 类细胞因子 和 的产生，因此，是细胞免疫重要的激活剂，不仅是 细胞分化的关键调控因子，而且可以激活巨噬细胞介导固有免疫。这提示结核分枝杆菌感染后通过下调 的表达水平而使机体处于免疫抑制状态，帮助结核分枝杆菌为逃逸免疫系统。姜丽娜等学者用 作用人外周血中性粒细胞或多形核细胞（），观察 对 吞噬 功能的影响。结果发现，对结核病患者和正常人 吞噬 功能随 浓度增加而增强。本研究依据肺结核诊断和治疗指南诊断标准，再将 例 患者分为活动期组和稳定期组两组。应用 检测 患者 中 的 表 达，发 现患 者 组 的 表达量明显高于对照组，并且活动期组的上调量高于稳定期组，两组比较有显著性差异，提示 在 的发病过程中发挥了作用，可能参与了 的炎症反应调节。检测了 患者血清 表达水平，结果显示，患者血清 含量高于对照组。患者的临床分期不同，其 的含量也不同，活动期组 含量明显高于稳定期组。进一步分析 含量与 临床实验室、指标检测的相关性发现，患者 含量与、水平有一定的相关，提示 与 感染后抗体的产生关系较为密切，我们推测、及 可以作为 诊断和判断预后的重要指标，其较高的抗体水平常提示患者病情较重，进展快，提示 水平与 的病情严重程度具有一定相关性，可作为评估病情严重程度的指标而进一步指导临床诊治。综上所述，患者中 水平显著增加，并且活动期患者 水平明显高于稳定期患者，表明 参与了 的发病过程。患者血清 水平与、等 诊断指标呈正相关，提示 可作为评估病情严重程度的指标。因此，作为 的一种抗原可用于结核病的实验室诊断。在 诊断和治疗上有潜在应用价值，但由于本试验样本量较少，实验人群范围有限，还需进一步研究与探讨。在后续研究中，我们拟通过采用免疫脂质体 等蛋白质超敏检测及免疫组化、流式细胞术等手段来评价 检测性能，尽早实现结核病的快速、准确诊断。参 考 文 献，：，（）：金武，杜鹃不同结核类型患者外周血 与 和 及 水平的动态变化研究中华医院感染学杂志，（）：，：，（）：唐宇龙，杨华，刘湘新，等三种结核分枝杆菌分泌蛋白的抗体制备及在抗原检测中的应用中华传染病杂志（）：，（）：，（）：，（），（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：尹芳，胡月圆，郭琼，等细胞因子、及 增强结核杆菌 疫苗的免疫保护作用免疫学杂志，（）：姜丽娜，姚春艳，金齐力，等 增强结核病患者中性粒细胞吞噬和杀伤结核杆菌的活性细胞与分子免疫学杂志，（）：杨倩婷，邓国防，尤信信，等 在结核患者中的表达及在诊断中的应用新发传染病电子杂志，（）：（收稿日期：）齐齐哈尔医学院学报 年第 卷第 期 ，