Mdr2基因敲除小鼠建立原发性肝癌模型观察_李萌.pdf

2022 年 12 月第 30 卷 第 8 期中国实验动物学报ACTA LABORATORIUM ANIMALIS SCIENTIA SINICADecember 2022Vol.30 No.8李萌,平键,徐列明.Mdr2 基因敲除小鼠建立原发性肝癌模型观察 J.中国实验动物学报,2022,30(8):1058-1063.Li M,Ping J,Xu LM.Establishment of a primary liver cancer model in Mdr2 gene knockout mice:an observational study J.Acta Lab Anim Sci Sin,2022,30(8):1058-1063.Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2022.08.006基金项目上海市科委项目(15401902600),上海中医药大学“研究生创新培养”专项科研项目(Y2021070)。Funded by the Shanghai Science and Technology Commission Project(15401902600),Special Scientific Research Project of“Innovation Training for Postgraduates”of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine(Y2021070).作者简介李萌(1995),女,在读博士研究生,研究方向:中西医结合肝病防治。Email:limeng95 通信作者 平键(1976),男,副研究员,博士,研究方向:中西医结合肝病防治。Email:jian_ping Mdr2 基因敲除小鼠建立原发性肝癌模型观察李萌1,2,平键1,2,3,徐列明1,2,3(1.上海中医药大学附属曙光医院,上海 201203;2.上海中医药大学肝病研究所,上海 201203;3.肝肾疾病病证教育部重点实验室,上海 201203)【摘要】目的 观察 C57BL/6 背景的 Mdr2 基因敲除小鼠自发肝肿瘤形成情况。方法(11.3 4.2)周龄Mdr2 基因敲除 C57BL/6-Abcb4tm1小鼠9 只和野生型 C57BL/6 小鼠5 只,连续饲养65 周后处死小鼠,留取血清及肝标本。检测血清 ALT、AST、AFP 水平,肝组织石蜡切片做 HE、天狼猩红染色,免疫组织化学检测肿瘤及肿瘤旁组织CK-7、CK-19 表达情况。结果 9 只 Mdr2 基因敲除小鼠均自发形成肝肿瘤,血清 ALT、AST、AFP 水平均显著高于野生型小鼠(P 0.01),Mdr2 基因敲除小鼠肝肿瘤 CK-7、CK-19 染色均为阴性。结论 Mdr2 基因敲除小鼠连续饲养至(76.3 4.2)周龄时均自发形成肝肿瘤,其病理组织分型为肝细胞癌。【关键词】原发性肝癌;小鼠模型;Mdr2;基因敲除;胆汁淤积【中图分类号】Q95-33 【文献标识码】A 【文章编号】1005-4847(2022)08-1058-06Establishment of a primary liver cancer model in Mdr2 gene knockout mice:an observational studyLI Meng1,2,PING Jian1,2,3,XU Lieming1,2,3(1.Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China.2.Institute of Hepatology,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203.3.Key Laboratory of Liver and Kidney Diseases,Ministry of Education,Shanghai 201203)Corresponding author:PING Jian.E-mail:jian_ping 【Abstract】ObjectiveTo observe spontaneous liver tumor formation in Mdr2 knockout mice with C57BL/6 background.MethodsFive wild type C57BL/6 mice and nine Mdr2 knockout C57BL/6-Abcb4tm1 mice aged(11.3 4.2)weeks were sacrificed after 65 weeks of continuous feeding.Serum and liver samples were collected and serum ALT,AST,and AFP levels were measured.Paraffin-embedded sections of liver tissue were stained with HE and Sirius red.CK-7 and CK-19 expression in tumor and adjacent tissues was detected by immunohistochemistry.ResultsNine Mdr2 knockout mice formed liver tumors spontaneously.Serum ALT,AST,and AFP levels were significantly higher than those in wildtype mice(P 0.01).CK-7 and CK-19 expression was negative in Mdr2 knockout mice.ConclusionsThe Mdr2 knockout mice formed liver tumors spontaneously when continuously fed to(76.3 4.2)weeks of age,and their pathological classification was hepatocellular carcinoma.【Keywords】primary liver cancer;mouse model;Mdr2;gene knockout;cholestasisConflicts of Interest:The authors declare no conflict of interest.中国实验动物学报 2022 年 12 月第 30 卷第 8 期 Acta Lab Anim Sci Sin,December 2022,Vol.30,No.8 原发性肝癌是我国最常见的消化系统恶性肿瘤之一,不仅严重威胁人民生命健康,也为医疗资源带来重大负担。据统计,肝癌在 2020 年全球新发癌症疾病谱中排名第七位,在癌症致死人数中占第三位1。原发性肝癌包括两种主要的组织学类型:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)和肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC),其 中ICC 约占原发性肝癌的 15%2-3。研究肝癌发病的机制既是重点也是难点,而选择适宜的原发性肝癌动物模型则是肝癌机制研究的必要条件。Mdr2(multidrug resistance protein2,Mdr2)基因,又名 ATP-结合盒 B 亚家族成员 4(ATP-binding cassette subfamily B member 4,Abcb4),其编码的Mdr2 蛋白作为一种脂质转运蛋白,能够将胆汁中磷脂的主要成分 磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)从肝毛细胆管膜的内侧转移到外侧2。小鼠Mdr2 基因敲除后,PC 无法通过 Mdr2 蛋白被分泌到胆汁中,从而造成胆汁中磷脂的缺乏4。磷脂缺乏时,胆盐和胆固醇无法与之形成混合胶束,造成胆盐游离,引起胆管细胞损伤并导致胆汁淤积4-5。文献报道显示,小鼠 Mdr2 基因敲除后表现为肝内外胆管的狭窄和狭窄所致的节段性扩张、“洋葱皮样”胆管周围纤维化和胆管局部性增生,并且随时间推进,逐渐发展为肝纤维化、肝硬化,甚至肝癌6。因其肝形态学变化与人类原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis,PSC)相 似,Mdr2-/-小鼠也是目前最常用的 PSC 转基因动物模型7。已有学者使用 Mdr2-/-小鼠进行肝癌机制研究,但不同遗传背景的 Mdr2-/-小鼠肝癌发生时间存在一定差异。为此,本文观察了 C57BL/6 背景Mdr2-/-小鼠原发性肝癌的发生时间及发生率,并对其组织学类型进行了鉴定。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物9 只 SPF 级 Mdr2 基因敲除小 鼠 C57BL/6-Abcb4tm1,包括雌 6 只、雄 3 只,(11.3 4.2)周龄,约22 g。同周龄及体重的SPF 级野生型小鼠C57BL/6 野生型小鼠 5 只(雌 3 只,雄 2 只)亦购自苏州赛业实验动物技术有限公司【SCXK(苏)2018-0003】。小鼠饲养于上海中医药大学实验动物中心【SYXK(沪)2020-0009】,普通饲料饮食,自由饮水,相对湿度(55 5)%,温度 25,光照遵循昼夜节律。本实验通过上海中医药大学实验动物中心和实验动物伦理委员会批准(PZSHUTCM190524006),并且严格遵守实验动物使用的 3R 原则。由苏 州 赛 业 实 验 动 物 技 术 有 限 公 司 采 用CRISPR/Cas9 技术构建并采用 PCR 和产物测序进行鉴定。Abcb4 基因位于小鼠第 5 号染色体上(NCBI 参考序列:NM_008830),共鉴定出 28 个外显子,选择第 3 4 外显子作为目标位点,设计 gRNA(gRNA1 5-TACCAAGGGCGGTACCTTCAAGG-3;gRNA2 5-GCTCCTTACCACAATGGTACTGG-3)将此段基因进行剪切(见图 1A)。产生的小鼠进行PCR 扩增验证(引物 F2 5-CTTTGCAGCTAAATA AAGTGGGAC-3,引物 R1 5-TCCACCCTAGACC CTTATTGTCTC-3),然后对 PCR 产物进行测序,分析测序结果,确认基因型(见图 1B)。通过杂合子互配进行扩增繁殖,并采用 PCR(引物 F1 5-TGTCATCTGGCAATTTAGGCTG-3,引物 R1 5-TCCACCCTAGACCCTTATTGTCTC-3,612 bp;引物F2 5-CTTTGCAGCTAAATAAAGTGGGAC-3,引物 R1 5-TCCACCCTAGACCCTTATTGTCTC-3,652 bp;纯合子小鼠仅在 612 bp 处出现条带)筛选出纯合子小鼠用于实验(见图 1C),其反应条件为:94 3 min,(94 30 s,60 35 s,72 35 s)35循环,72 5 min。1.1.2 主要试剂与仪器丙氨酸氨基转移酶(laninne aminotransferase,ALT)、天 门 冬 氨 酸 氨 基 转 移 酶(aspartate aminotransferase,AST)检测试剂盒,均为南京建成科技有限公司产品;甲胎蛋白(alpha fetal protein,AFP)检测试剂盒为酶联生物公司产品;细胞角蛋白7(cytokeratin-7,CK-7)I 抗购自 Abcam 公司;细胞角蛋白 19(cytokeratin-19,CK-19)I 抗购自 proteintech公司;通用二步法试剂盒、DAB 显色试剂盒,均购自中杉金