CDK1在多形性胶质母细胞瘤中的表达及其相关性研究_刘俊鹏.pdf

继续医学教育 2023年1月 第37卷 第1期 145CDK1在多形性胶质母细胞瘤中的表达及其相关性研究作者单位：赤峰学院附属医院神经外二科，内蒙古 赤峰 024000刘俊鹏【摘要】目的 现代学者通过多种方法进行研究发现，细胞周期蛋白依赖性激酶 1（cyclin-dependent protein kinase 1，CDK1）在当今已知的多种肿瘤组织中呈现出高表达现象，而且还可能与肿瘤发展密切相关。但如今对于 CDK1 基因在多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）中的作用尚不明晰。所以，研究主要是对 CDK1 基因在多形性胶质母细胞瘤的增殖调节中起到的影响进行初步探讨。方法 从 GEPIA 在线数据库与 proteinatlas 在线数据库中提取了 CDK1 在各种肿瘤中的表达。选取 2019 年 8 月至 2021年 9 月期间赤峰学院附属医院收治的 54 例多形性胶质母细胞瘤患者，记录年龄、性别、部位、复发和 IDH1 变异等情况后进行相关性分析，并通过免疫组化染色比较 CDK1在多形性胶质母细胞瘤和癌旁正常组织中的表达水平，并观察其差异，进而得出结论。结果 通过上述 2 个数据库中的资料发现，与正常组织相比，多形性胶质母细胞瘤中CDK1 基因的表达水平上调。多形性胶质母细胞瘤临床病理特征中和复发有关（P=0.016），和年龄、性别、部位和IDH1 变异情况无关。通过进一步的试验而发现，病理切片组织的免疫组织化学染色法（immunohistochemistry，IHC）表明在癌组织中的 CDK1 表达呈高水平。结论 试验的结果表明，GBM 的异常增殖与细胞周期蛋白依赖性激酶 1 的高表达相一致。它们的表达与多形性胶质母细胞瘤的病理性增殖有关，而且多形性胶质母细胞瘤临床病理特征中和复发有关，和年龄、性别、部位和 IDH1 变异情况无关。所以，CDK1 可能是未来的一种治疗靶点，可为其治疗提供一种新的策略。【关键词】多形性胶质母细胞瘤；CDK1；临床病理特征；增殖；免疫组化；预后【中图分类号】R741 【文献标志码】A【文章编号】1004-6763（2023）01-0145-04doi:10.3969/j.issn.1004-6763.2023.01.037多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是现今已知类型的胶质瘤中较为常见的一种，同时也是一种与其他已知同类型肿瘤相比恶性程度较高，而且致死率同样极高的亚型。它起源于大脑的神经上皮组织群，即星形细胞瘤，这种肿瘤具有较高度的侵袭性，容易发生大范围的浸润和转移，而且肿瘤的形态常常不固定，范围也同样不明。多形性胶质母细胞瘤与其他癌症一样，都是在肿瘤周围的免疫抑制的微环境下生长，通常表现为非特异性的体征和症状，从头痛到个性改变均可发生。同时，多形性胶质母细胞瘤也常常被称为级胶质瘤，占总胶质瘤病例的 50%，男性发病率高于女性1。虽然现代医学在治疗该类型疾病的医疗技术方面已经取得了比较巨大的进展，但是如今全世界各国多形性胶质母细胞瘤患者的总体生存时间与其他类型肿瘤相比依然更短。现代医学界对于多形性胶质母细胞瘤的标准治疗方法包括手术切除、放疗和化疗 3 种。目前，美国食品药品监督管理局批准通过系统给药治疗多形性胶质母细胞瘤的药物只有两种：一是用于治疗新诊断多形性胶质母细胞瘤的替莫唑胺（temozolomide，TMZ），二是用于治疗复发性多形性胶质母细胞瘤的贝伐珠单抗（bevacizumab，Avastin）。不幸的是，目前通过上述两种药物的治疗方法对改善多形性胶质母细胞瘤患者预后的影响非常有限，其中位生存期仅为 15 个月，而且其 5 年生存率尚不到 5%。而且通过手术治疗该疾病的复发率很高，故而仍然对人们的健康生活产生了相当严重的威胁1。因此，本研究仍然需要寻找更为有效的治疗多形性胶质母细胞瘤的方法。细胞周期蛋白依赖性激酶 1（cyclin-dependent protein kinase 1，CDK1）属于于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，是由细胞分裂周期基因 2（cell division cycle，CDC2）编码的，具有高度的保守性，在正常的细胞周期中起到了不可替代的作用2。其与细胞内的 cyclinA 和 cyclinB 结合而发挥作用，主要调控有丝分裂与减数分裂，进而实现了对整个细胞周期的调控，主要参与了染色体分离、子细胞的形成与分离、细胞骨架重组等3。现代学者通过多种方法进行研究发现，在多种恶性肿瘤中 CDK1 基因均有出现异常的高水平表达现象，如胰腺癌、结肠癌、肝细胞癌以及卵巢癌等，这些研究提示 CDK1 基因参与了多种恶性肿瘤的发生与发展的过程4。虽然有研究报道 CDK1 在很多恶性肿瘤中，与正常组织相比表达上具有差异性，但其与多形性胶质母细胞瘤的关系暂不明确5。而且 CDK1 在正常细胞周期中的相关功能已被广泛研究，但对于这种激酶是否具有额外的、细胞类型特异性的或组织特异性的、与细胞周期无关的功能，人们现在知之甚少。因此，本研究的主要目的是初步探讨 CDK1 基因对多形性胶质母细胞瘤增殖调节及患者预后的影响。1 资料与方法1.1 临床资料本研究选择了本院于 2019 年 8 月至 2021 年 9 月期间收治的多形性胶质母细胞瘤患者总共 54 例。在这 54 名患者中，男性患者一共为 36 例，女性患者一共为 18 例。本研究患者的平均年龄为（52.36.73）岁。全部病例均已经过病理证实，而且全部都具有完整的病例资料。本试验收集了 54 例患者的一般临床资料，其中包括了患者的年龄、性别、发病部位、复发以及 IDH1 变异情况等。在这 54 例多形性胶质母细胞瘤病例中，肿瘤位于幕上者总共为 15 例，位于幕下者总共为 39 例；肿瘤 IDH1 变异者总共为 17 例，146 Continuing Medical Education,January 2023,Vol.37,No.1未变异者总共为 37 例；而肿瘤复发者总共为 43 例，未复发者总共为 11 例。在获取这些资料前，本研究已经获得了所有参与本研究的多形性胶质母细胞瘤患者及其家属们的同意。患者纳入本次研究的标准同先前已知病例研究分析标准相同，均为：1）术前未开展放疗与化疗干预；2）符合手术指征；3）病例资料齐全；4）患者及家属均已知情同意。1.2 数据提取本试验通过应用 GEPIA 在线数据库与 proteinatlas 在线数据库提取 CDK1 在不同组织器官内的表达（http:/gepia.cancer- CDK1 基因在多形性胶质母瘤细胞中的表达差异。1.3 抗体本试验中涉及的免疫组化抗体如下：兔抗人重组 Anti-CDK1 抗体 BLR085G（ab265590，Abcam plc，剑桥，英国），1 200。1.4 免疫组化实验本实验采用了免疫组化试剂盒进行免疫组化的检测，使用患者食管癌样本的石蜡切片 3 4 m，且每个患者的样本均置于 70环境下烤 45 min，随后放入二甲苯溶液浸泡 10 min，再放入无水乙醇中浸泡 5 min；再放入二甲苯溶液浸泡 10 min，并依次分别放入 95%、85%和 75%的乙醇溶液中各 5 min。之后，将切片标本在磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）中洗涤 2 次，每次 2 min。再将切片置于枸橼酸钠缓冲液中并放入微波中。然后，将切片置于在室温下放置 2 h，并用 PBS 缓冲液洗涤 2 次，每次2 min。在除去多余的水分后，切片在室温下加入 H2O2 后在湿箱中放置 20 min，再次洗涤，之后滴入 Anti-CDK1 抗体（ab265590，Abcam plc，剑桥，英国），以 1 200 的稀释度对 KIF2A 进行免疫染色，并在 4环境下过夜。次日，将切片室温放置 1 h，用 PBS 缓冲液洗涤 2 次，每次 2 min。之后，在室温下滴加 IgG 二级抗体，静置 2 h。再用 PBS 缓冲液再次洗涤，滴加 DAB（用 A 液和 B 液预先配制），室温下染色约 5 15 s。用水冲洗掉表面染料，然后用苏木精溶液染细胞核 5 8 s，用水冲洗约 2 min。最后，用中性树胶封片后在显微镜下观察。该切片标本观察结果的判定标准与先前已知病例研究分析的判定标准相同，均为 2 名病理医师在双盲状态下，在高倍镜下对病理切片进行观察，如发现标本细胞中出现明显染色颗粒判为阳性。在每份病理切片中随机选择 3 个视野，每个视野下计数 100 个肿瘤细胞，共计 300 个。随后计算阳性细胞所占百分比，如阳性细胞率 10%判断为阳性，反之判断为阴性。1.5 统计学处理本文的统计分析结果，包括数据分析和图表绘制等，均使用 GraphPad 8.0 统计分析软件对得到的数据进行分析，而且之后两组数据之间也均采用t检验和2检验在统计学意义上分析了 CDK1 在多形性胶质母瘤中的作用。本研究中所有数据均通过统计学分析进行比较，计量资料以（x-s）表示，而P 0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 CDK1 在多种肿瘤中表达上调现今的大量研究表明，CDK1 在多种恶性肿瘤中均表达上调较为明显，并且与这些肿瘤的复发均存在有较为密切的关系。为了对此加以印证，本研究通过 proteinatlas 在线数据库分析了 CDK1 在多种组织器官恶性肿瘤中的表达量，见（图 1），而数据库分析结果显示，在大多数恶性肿瘤患者的体内都伴随有 CDK1 的高表达。随后，本研究又通过 GEPIA 在线数据库对多形性胶质母细胞瘤进行了分析比较，其分析比较的结果表明，多形性胶质母细胞瘤组织中的 CDK1 表达量与癌旁正常组织的CDK1 表达量相比具有显著增高的现象，见（图 2），这一结果与之前诸多研究报道的结果相一致。2.2 CDK1 在舌鳞状细胞癌中表达上调并与预后相关本研究收集了本院收治的 54 例确诊患者的多形性胶质母细胞瘤标本及其癌旁正常组织的标本，同时将它们通过免疫组化法对 CDK1 的表达量进行了检测。通过分析试验结果，本研究发现 CDK1 在多形性胶质母细胞瘤中的表达明显高于正常组织，见（图 3）。为了确定 CDK1 对多形性胶质母细胞瘤进展的影响，本研究根据其染色强度进一步将这些病例分为高组和低组，见（图 4），并且进一步探讨了 CDK1 的表达与几个临床参数（包括年龄、性别、发病部位、复发以及 IDH1 变异情况等）之间的关系，见（表 1）。其研究结果表明，CDK1 的表达与肿瘤的复发情况密切相关，差异有统计学意义（P=0.016），见（表 1），但是与年龄、性别、部位以及 IDH1 变异情况比较差异无统计学意义（P 0.05）。这些结果与数据库的结果基本相一致。综上，CDK1 在多形性胶质母细胞瘤中表达上调，并且与复发相关，所以该基因可能会是一种潜在的治疗靶点，可以为该病患者提供一种新的治疗策略。3 讨论多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤之一，这种肿瘤有高度的侵袭性，容易发生大范围的浸润和转移6。多形性胶质母细胞瘤主要分为两类：异柠檬酸脱氢酶野生型多形性胶质母细胞瘤，以前被称为原发性多形性胶质母细胞瘤，约占 90%的病例；异柠檬酸脱氢酶突变型多形性胶质母细胞图 1 CDK1 在不同肿瘤组织中的表达情况继续医学教育 2023年1月 第37卷 第1期 147瘤，由低级别弥漫性胶质瘤发展而来，约占 10%的病例。随着分子生物学和基因组学的发展，GBM 也可分为分子亚型，即经典型、间充质型、前神经型和神经型7。现代医学对于此类疾病的治疗方法主要有外科手术摘除、化学疗法、放射疗法与生物免疫疗法等，这其中以手术摘除最为常用，同时也最为有效。但是，手术后多形性胶质母细胞瘤患者的预后大多不良，多个研究结果表明其中位生存时间均小于 15 个月，且极易复发，其复发率可达图 2 GBM 组织的 CDK1 表达量