6种内生菌对发酵人参茎叶农药残留降解和皂苷转化的影响_田颖.pdf

中国现代应用药学 2023 年 2 月第 40 卷第 4 期 Chin J Mod Appl Pharm,2023 February,Vol.40 No.4 483 6 种内生菌对发酵人参茎叶农药残留降解和皂苷转化的影响 田颖1，郜玉钢1,2，张雪1，高飞1，王茜1，臧埔1,2*(1.吉林农业大学中药材学院，长春 130118；2.吉林省人参工程技术研究中心，长春 130118)摘要：目的 研究 6 种内生菌对人参茎叶中 5 种农药残留降解和 20 种皂苷单体转化的影响。方法 在同一培养条件下，通过 GC、HPLC 分别对 6 种人参内生芽孢杆菌处理前后人参茎叶中农药残留及人参皂苷含量进行测定，计算 6 种内生菌对人参茎叶中农药残留率和皂苷转化率，评价内生菌对人参茎叶转化产物质量的影响，优选出降农残和转化皂苷效果好的菌株。结果 6 种人参内生菌对人参茎叶中的 5 种农药残留均有降解作用，其中，多黏类芽孢杆菌对农药残留降解作用最强，氟啶胺、六六六、五氯硝基苯、毒死蜱、滴滴涕的降解率分别为 86.90%，88.89%，79.88%，86.12%和 86.67%(P0.05)；对 20 种单体皂苷均有转化作用，其中，赖氨酸芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌转化人参茎叶皂苷作用最强，20 种单体皂苷加和值分别为 5.84%和 5.85%(P0.05)。结论 6 种内生菌对人参茎叶农药残留降解和皂苷转化的影响不同，多黏类芽孢杆菌降解农药残留效果最好，赖氨酸芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌转化人参皂苷效果最好，为提高人参茎叶总皂苷提供理论依据。关键词：人参内生菌；人参茎叶；农药残留降解；人参皂苷转化 中图分类号：R282.2 文献标志码：B 文章编号：1007-7693(2023)04-0483-06 DOI:10.13748/ki.issn1007-7693.2023.04.008 引用本文：田颖,郜玉钢,张雪,等.6 种内生菌对发酵人参茎叶农药残留降解和皂苷转化的影响J.中国现代应用药学,2023,40(4):483-488.Effects of Six Kinds of Endophytes on Pesticide Residue Degradation and Conversion of Saponins in Ginseng Stems and Leaves TIAN Ying1,GAO Yugang1,2,ZHANG Xue1,GAO Fei1,WANG Xi1,ZANG Pu1,2*(1.College of Chinese Medicinal Materials,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China;2.Jilin Province Ginseng Engineering Technology Research Center,Changchun 130118,China)ABSTRACT:OBJECTIVE To study the effects of 6 kinds of endophytes on the degradation of 5 pesticide residues and the conversion of 20 saponin monomers in the stem and leaves of ginseng.METHODS Under the same culture conditions,the contents of pesticide residues and ginsenosides in the stems and leaves of ginseng before and after treatment with 6 kinds of endophytes were determined by GC and HPLC,respectively.The pesticide residue rate and ginsenoside conversion rate of 6 kinds of endophytie in stems and leaves of ginseng were calculated.The effects of endophytes on the quality of transformation products of stems and leaves of ginseng were evaluated,and the strains with good effect of reducing agricultural residues and transforming ginsenosides were selected.RESULTS Six kinds of ginseng endophytes could degrade five kinds of pesticide residues in ginseng stems and leaves,among which Bacillus polymyxa had the strongest degradation effect on pesticide residues.The degradation rates of fluazinam,benzene hexachloride,pentachloronitrobenzene,chlorpyrifos and dichlorodiphenyltrichoroethane were 86.90%,88.89%,79.88%,86.12%and 86.67%,respectively(P0.05).It could transform 20 kinds of monomer saponins,among which Bacillus lysine and Bacillus cereus had the strongest effect on transforming ginseng stem and leaf saponins,and the sum values of 20 monomer saponins were 5.84%and 5.85%respectively(P 98%；人参皂苷对照品 Rgl(批号：201511)、Re(批号：201523)、Rg2(批号：201545)、Rg3(批号：201506)、Rg5(批号：201524)、Rf(批号：201537)、F1(批号：201549)、F2(批号：201521)、Rc(批号：201536)、Rd(批号：201579)、Rb1(批号：201501)、Rb2(批号：201551)、Rb3(批号：201518)、Rh2(批号：201543)、compound K(批 号：201520)、20(R)-Rh1(批号：201515)、Rk3(批号：201562)、Rh4(批号：201571)、原人参二醇(批号：201519)、原人参三醇(批号：201513)均来自吉林大学天然药物化学实验室，质量分数均98%。2 方法 2.1 内生菌菌液的制备 将适量生长良好的解淀粉芽孢杆菌、黄岗山脉蕈状芽孢杆菌、多黏类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌6种内生菌分别接入装有 50 mL PDB 培养基的容量为 250 mL 锥形瓶中，28、120 rmin1往复摇床培养约 48 h，菌液用酶标仪测定，菌液 A600 nm值到达 0.5 时备用。2.2 内生菌活菌数的测定 精密吸取 20 L 稀释后的菌液滴加于 PDB 培养基上，并用涂布器将菌液涂布均匀，每个稀释浓度设置 3 个，于 28 培养箱中倒置培养约 24 h后取出，计算内生菌的总数目，再乘以稀释倍数，即可得到内生菌芽孢杆菌的总数。2.3 内生菌发酵人参茎叶的制备 精密称取 3.00 g 人参茎叶粉末放入三角瓶中，封口，100 灭菌 2 h。在无菌条件下，加入 50 mL无菌水，吸取 200 L 的 A600 nm值为 0.5 的菌液放入三角瓶，28，120 rmin1，往复摇床培养约24 h。设不接菌的处理组作为对照，7 d 后 40 干燥得发酵后人参茎叶粉末备用。2.4 农药残留样品的制备与测定 精密称取已干燥的发酵后人参茎叶粉末1.000 g 置于 l00 mL 具塞三角烧瓶中，加入丙酮-石油醚(14)20 mL，20 min 超声处理，静置，将上清滤到 100 mL 三角瓶中，加入丙酮-石油醚(14)15 mL，再提取 2 次，每次 10 min，滤液于 40 水浴下浓缩，挥干后用石油醚将残渣定容至 5 mL，加入 1 mL 10%的硫酸，振摇 1 min，630g 离心10 min，取上清于 40 水浴，减压浓缩至近干，加入 2 mL 正己烷溶解，0.22 m 有机滤膜过滤，备用。GC 测定条件参照笔者所在实验室的测定方 中国现代应用药学 2023 年 2 月第 40 卷第 4 期 Chin J Mod Appl Pharm,2023 February,Vol.40 No.4 485 法18。色谱柱：Agilent DB-1701 石英毛细柱(30 m0.25 mm，0.25 m)；检测器：ECD；检测器温度：300；进样口温度：200。程序升温：50 保持 3 min，以 10 min1升温至 180，保持 20 min，再以 10 min1升温至 260，保持 10 min；载气：高纯氮气(纯度 99.999%)；流速 1 mLmin1，采用分流进样，进样量 1.0 L；分流比：101。2.5 皂苷样品的制备与测定 精密称取已干燥的发酵后人参茎叶粉末0.50 g，置于小试管中，加入 5 mL 甲醇，密封，超声 1 h后静置过夜，第 2天再超声 1 h后，1 740g离心 15 min，取上清液过 0.22 m 有机滤膜放入液相小瓶，HPLC 测定皂苷含量，色谱条件参照笔者所在实验室建立的同时测定 20 种人参皂苷含量的方 法17：Johnsson JS 1546 色 谱 柱(4.6 mm 250 mm，5 m)；乙腈(A)-水(B)为流动相，梯度洗脱(040.00 min，82.00%79.00%B；40.00 42.00 min，79.00%74.00%B；42.0046.00 min，74.00%68.00%B；46.0066.00 min，68.00%66.20%B；66.0071.00 min，66.20%62.00%B；71.0077.70 min，62.00%50.92%B；77.70 78.00 min，50.92%50.90%B；78.0082.00 min，50.90%B；82.0083.00 min，50.90%49.40%B；83.0088.00 min，49.40%40.40%B；88.00 89.80 min，40.40%35.04%B；89.8092.00 min，35.04%35.00%B；92.0097.00 min，35.00%B；97.0102.00 min，35.00%15.00%B；102.00 109.00 min，15.00%B；109.00111.00 min，15.00%82.00%B)。柱温为 35，检测波长为203 nm，流速为 1.0 mLmin1，进样量为 10 L。2.6 降解率计算公式 121(%)100%AAA=降解率 式中：A1为对照样品残留量；A2为内生菌处理样品残留量。2.7 统计分析 使用Excel软件进行数据整理，采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，数据以 xs表示，组间比较采用单因素方差分析及 Dunnett-t 检验，P0.05表示差异具有统计学意义。3 结果与分析 3.1 6 种内生菌发酵结束后活菌数的测定 在 6 种内生菌发酵结束后测定菌液的活菌数，6 种内生菌在培养 7 d 发酵结束后，活菌数