“普薯32号”中LCYb基因的克隆与序列分析_唐锐敏.pdf

第 57 卷 第 1 期 广 东 蚕 业 Vol.57,No.01 2023 年 1 月 GUANGDONG CANYE Jan.2023 37 DOI：10.3969/j.issn.2095-1205.2023.01.12“普薯 32 号”中 LCYb 基因的克隆与序列分析 唐锐敏 石源睿 徐子舟 贾小云（山西农业大学生命科学学院 山西晋中 030801）摘 要 作为我国的一种重要粮食作物，甘薯在抵抗饥荒、保障粮食安全方面发挥着重要作用。近年来，对甘薯的营养和保健功效的研究越来越多，许多以甘薯为原料的新型食品被开发出来。-胡萝卜素是甘薯中一种重要的生物活性物质，能够转化为维生素 A，维持人类眼睛和皮肤的健康，从而改善夜盲症、皮肤粗糙的状况。番茄红素-环化酶（LCYb）是参与-胡萝卜素合成的关键酶。本研究从橘肉甘薯品种“普薯 32 号”中分离得到 IbLCYb 基因，并对其进行序列分析和编码蛋白的理化性质分析等。结果表明：IbLCYb 基因的开放阅读框长度为 1 506 bp，编码 501 个氨基酸。该基因编码蛋白的相对分子质量为 56.45 kDa，理论等电点为 8.02，属于亲水性非跨膜蛋白。系统进化分析结果表明：甘薯 LCYb 与三裂叶薯 LCYb 的亲缘关系最近。这些结果为进一步研究甘薯 LCYb 的功能以及调控-胡萝卜素合成的机制提供理论基础。关键词 甘薯；LCYb 基因；基因克隆；-胡萝卜素；序列分析 中图分类号:S531 文献标识码:A 文章编号:2095-1205(2023)01-37-06 甘薯（Ipomoea batatas(L.)Lam.）是世界主要的粮食作物之一，其在亚洲的种植面积居世界首位，非洲次之1。根据成熟期薯肉颜色的不同，可将其分为白心甘薯、黄心甘薯、橙心甘薯和紫心甘薯等2。彩色甘薯块根因富含类胡萝卜素和花青素等次生代谢物，具有预防心血管疾病、抗肿瘤、调节免疫活性等功效，对人类健康具有巨大的潜在价值，因此成为开发功能食品的理想资源3。类胡萝卜素是一类重要天然色素的总称，普遍存在于动物、高等植物、真菌、藻类和细菌中4-5。-胡萝卜素作为类胡萝卜素家族中的重要一员，在植物体内具有多种生物学功能6-8。例如，-胡萝卜素可作为光合色素参与光合作用；能够防止植物因光氧化而受到损害9-10；能使花瓣和果实颜色鲜艳，从而吸引昆虫等动物授粉、传播种子11；还参与植物响应非生物胁迫的途径12-13。对人类而言，-胡萝卜素在抗氧化、解毒、预防心血管疾病、保护肝脏等方面具有重要的生理作用14。同时，-胡萝卜素也是维生素 A 的前体，可以预防夜盲症和视力丧失，有助于维持免疫系统的正常功能15。在植物体内，-胡萝卜素的合成过程中需要多种关键酶的参与。异戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基丙 基金项目：国家青年科学基金项目（31900450）；山西农业大学科技创新基金项目（2018YJ28）；山西省回国留学人员科研资助项目（2022-094）作者简介：唐锐敏（1990），女，汉族，山西长治人，博士研究生，副教授，研究方向为薯类作物次生代谢机制。烯基二磷酸（DMAPP）经过一系列的氧化还原反应合成-胡萝卜素16，其中番茄红素环化酶（LCY）调控红色的番茄红素转变为橙色的-胡萝卜素。研究表明，番茄红素与-胡萝卜素在植物体内所占比例的不同导致植物体所呈现的颜色有所不同，当植物体内番茄红素积累较多，果实大多呈现红色，而当-胡萝卜素较多时则呈现出橙色17。已报道的LCY 基因分为 LCYb 和 LCYe，前者的作用是控制番茄红素转化为-胡萝卜素，后者则是控制番茄红素向-胡萝卜素转化18-19。张亚卿的研究表明，在红肉蜜柚果实发育至成熟的整个过程中，LCYb 和 LCYe基因的表达量迅速降低，抑制番茄红素转化为类胡萝卜素，使得红肉蜜柚汁胞积累大量的番茄红素，果实呈现红色20。在烟草中过表达 LCYb 基因会影响烟草的类胡萝卜素组分比例，同时对烤后烟叶的香气物质含量也有所影响21。本研究从橙心甘薯“普薯 32 号”中克隆得到IbLCYb，利用生物信息学技术对其及其编码的蛋白质序列进行分析。研究结果为分析 IbLCYb 在-胡萝卜素合成途径中的调控作用提供一定的参考，为后续甘薯品种的创新及品质的提高奠定研究基础。第 1 期“普薯 32 号”中 LCYb 基因的克隆与序列分析 第 57 卷 38 1 材料与方法 1.1 植物材料、菌株及载体 试验所选甘薯品种为“普薯 32 号”（Pushu-32），由江苏省农业科学院徐州甘薯研究中心提供，于山西农业大学生命科学学院甘薯试验基地种植。转化所用菌株为大肠杆菌 DH5，由山西农业大学生命科学学院分子生物学实验室保存。克隆载体为 PMD19-T Vector。试验所用 Prime Scrip TM RT reagent Kit 反转录试剂盒、Marker DL 系列，购自 TaKara 公司；PCR 纯化回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购于 Axy Prep 公司；RNA 提取试剂盒购于北京华越洋公司；PCR Mix聚合物购自迈维生物。1.2 RNA 的提取和 cDNA 的合成 取种植 90 d 的甘薯块根 0.1 g，用液氮快速冷冻并进行研磨。每个样品做 3 个生物学重复。使用 RNA 提取试剂盒对甘薯块根的总 RNA 进行提取，后使用琼脂糖凝胶电泳检测所提 RNA 的完整性和质量，并根据TaKara反转录试剂盒说明书对所提RNA进行反转录。1.3 IbLCYb 基因克隆 根据 NCBI 官网上查到的甘薯 IbLCYb 基因预测序列克隆引物，IbLCYb-F为ATGGATACTTTGCTAAAG，IbLCYb-R 为 TTAATCTATATCCTGTAAC。以反转录得到的甘薯 cDNA 为模板，对 IbLCYb 基因进行克隆。反应程序：94 预变性 2 min，94 变性 30 s，43.6 退火 30 s，72 延伸 1 min，35 个循环，72 终延伸 2 min。扩增产物通过凝胶回收试剂盒（Axygen Scientific Inc.,Union city,USA）将目的片段回收，并与 PMD19-T 相连，获得重组质粒 PMD19-T-IbLCYb。将重组质粒转入大肠杆菌 DH5，并将其涂布于含有氨苄青霉素的 LB平板培养基上进行过夜培养 15 h17 h。挑取单克隆进行菌落 PCR，将阳性克隆所提取的质粒送至上海生工生物公司进行测序，阳性克隆的菌液和所提质粒冻于-80 保存。1.4 甘薯 IbLCYb 基因的生物信息学分析 生物信息学分析软件如表1所示，对IbLCYb编码蛋白的亲疏水性、理化性质、跨膜结构、信号肽、二级结构、三级结构进行预测分析。利用甘薯 IbLCYb编码的蛋白序列，通过 BLASTp 在 NCBI 数据库中搜索其他植物 LCYb 的蛋白序列，使用 MEGA7.0 软件，构建 Neiber-Joing（NJ）系统发育树，Bootstrap 分析重复数为 1 000。表 1 生物信息学所用分析软件 软件名称 作用 网址 ProtParam 理化性质分析 https:/web.expasy.org/protparam/ProtScale 亲疏水性分析 https:/web.expasy.org/protscale/TMHMM Server v.2.0 跨膜结构螺旋分析 https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0NPSA-PRAB 蛋白二级结构预测 http:/npsa-pbil.ibcp.fr SWISS-MODEL 蛋白三级结构预测 https:/www.swissmodel.expasy.org/2 结果与分析 2.1 橘肉甘薯“普薯 32 号”块根 RNA 的提取及IbLCYb基因克隆 利用 RNA 提取试剂盒提取“普薯 32 号”块根的总 RNA，其琼脂糖凝胶电泳结果呈现出 3 条带，分别是 5s、18s 和 28s（见图 1A）。以 IbLCYb-F/R 为克隆引物，“普薯 32 号”的cDNA为模板对甘薯IbLCYb进行基因克隆。经琼脂糖凝胶电泳检测，得到了一条长度为 1 506 bp 的特异性条带，为 IbLCYb（见图 1B）。将目的片段割胶回收，连接 PMD19-T 载体，转化大肠杆菌后进行菌落PCR，目的片段大小与 cDNA 长度相一致。对含有目的片段的阳性克隆进行扩繁，提取阳性克隆的质粒寄送至生物公司进行测序，测序结果与 NCBI 网站上甘薯 IbLCYb 预测序列相比，相似度达 99.67%（见图2），说明通过试验所得到的结果的确是甘薯 IbLCYb基因的序列。图 1“普薯 32 号”块根 RNA 琼脂糖凝胶电泳（A）及 IbLCYb 的扩增产物条带（B）第 1 期“普薯 32 号”中 LCYb 基因的克隆与序列分析 第 57 卷 39 图 2 IbLCYb 测序结果与 NCBI 网站预测序列比对2.2 甘薯 IbLCYb 蛋白的理化性质分析 对 IbLCYb 蛋白的理化性质进行分析，结果显示IbLCYb 基因编码 501 个氨基酸（见图 3A），IbLCYb蛋白的相对分子质量为 56.45 kDa，理论等电点为8.02。用 ProtScale 和 TMHMM Server v.2.0 工具在线分析该蛋白序列，可判断 IbLCYb 蛋白是一个无跨膜结构域的亲水不稳定蛋白（见图 3B 和图 3C）。图 3 IbLCYb 蛋白的氨基酸序列（A）、疏水性分析（B）及跨膜域分析（C）2.3 甘薯 IbLCYb 蛋白结构分析 IbLCYb 蛋白的二级结构由 螺旋、片层、转角及无规卷曲构成，其中占比最多的是无规卷曲和 螺旋，所占比例分别为 41.52%和 37.3%，片层次之，为 16.17%，转角最少，为 4.99%（见图 4A）。其三级结构也表明，IbLCYb 蛋白中无规卷曲和 螺旋最多（见图 4B）。图 4 IbLCYb 蛋白序列二级结构及三级结构预测分析 90IbLCYb1 90IbLCYb2 90IbLCYb_in_NCBIConsensusaAAAtTTTgGGGgGGGaAAAtTTTaAAAcCCCtTTTtTTTtTTTgGGGcCCCtTTTaAAAaAAAaAAAgGGGaAAAcCCCcCCCcCCCcCCCtTTTaAAAaAAAtTTTgGGGaAAAgGGGcCCCtTTTtTTTgGGGaAAAaAAAtTTTtTTTtTTTcCCCtTTTgGGGcCCCaAAAcCCCcCCCcCCCaAAAcCCCaAAATCTcCCCaAAAtTTTgGGGgGGGgGGGtTTTtTTTtTTTgGGGcCCCaAAAgGGGtTTTtTTTaAAAaAAAaAAAgGGGcCCCtTTTaAAAgGGGtTTTgGGGcCCCcCCCtTTTtTTTtTTTaAAAcCCCcCCCtTTTcCCCcCCCcCCCtTTTgGGG 180IbLCYb1 180IbLCYb2 180IbLCYb_in_NCBIConsensusaAAAaAAAgGGGcCCCcCCCtTTTcCCCaAAAaAAAaAAAaAAAaAAAcCCCaAAAgGGGgGGGaAAAaAAAaAAAtTTTtTTTaAAAgGGGgGGGaAAAtTTTtTTTgGGGgGGGtTTTtTTTcCCCaAAAtTTTgGGGgGGGaAAAaAAAaAAAcCCCcCCCtTTTtTTTgGGGcCCCaAAAgGGGgGGGaAAAaAAAtTTTgGGGtTTTtTTTgGGGgGGGcCCCcCCCgGGGtTTTgGGGtTTTtTTTaAAAaAAAgGGGgGGGcCCCcCCCaAAAgGGGcCCCaAAAgGGGtTTTaAAAgGGGtTTTgGGGcCCCcCCCcCCCtTTTaAAAtTTTtTTTaAAAgGGGaAAAgGGG 270IbLCYb1 270