HPLC法同时测定蒲公英中4种活性成分的含量_卢秋红.pdf

收稿日期：2022-02-04基金项目：国家自然科学基金（编号：82074286）；江苏省“六大人才高峰”高层次人才（编号：SWYY-013）；江苏省 自然科学基金（编号：BK20191428）；江苏省中医药管理局中医药科技发展专项（编号：2020ZX21）作者简介：卢秋红，副主任药师，E-mail:*通讯作者：冯春来，教授，博士生导师，E-mail:HPLC法同时测定蒲公英中4种活性成分的含量卢秋红1，孙梦秋2，包 明2，刘嘉璐2，冯春来2*（1.镇江市第一人民医院，江苏 镇江 212000；2.江苏大学药学院，江苏 镇江 212013）摘 要：目的 建立一种同时测定蒲公英中绿原酸、菊苣酸、咖啡酸、木犀草素含量的高效液相色谱方法。方法 采用InertSustainTM ODS-C18色谱柱（250 mm4.6 mm，5 m），流动相为乙腈-0.1%乙酸水溶液，梯度洗脱，流速为1 ml/min，柱温为30，检测波长为325 nm。结果 绿原酸、菊苣酸、咖啡酸、木犀草素在5100 g/ml范围内线性关系良好，平均加样回收率在99.83%102.05%之间；检测限分别为0.11，0.09，0.06，0.07 ng，定量限分别为0.36，0.30，0.19，0.24 ng；精密度、稳定性、重复性、中间精密度试验的RSD均小于5%，且具有良好耐用性。结论 本方法简单高效、准确可靠，可用于蒲公英的质量控制。关键词：蒲公英；绿原酸；菊苣酸；咖啡酸；木犀草素；高效液相色谱法中图分类号：R927 文献标识码：A 文章编号：1672-979X（2023）01-0085-04DOI：10.3969/j.issn.1672-979X.2023.01.017Simultaneous Determination of Four Kinds of Active Components in Taraxaci Herba by HPLCLU Qiu-hong1,SUN Meng-qiu2,BAO Ming2,LIU Jia-lu2,FENG Chun-lai2（1.Zhenjiang First Peoples Hospital,Zhenjiang 212000,China;2.School of Pharmacy,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China）Abstract:Objective To establish an HPLC method for the determination of chlorogenic acid,cichoric acid,caffeic acid and luteolin in Taraxaci Herba at the same time.Methods The chromatographic separation was achieved on an InertSustainTM ODS-C18 column(250 mm4.6 mm,5 m),using acetonitrile-0.1%acetic acid solution at the flow rate of 1.0 ml/min as mobile phase for gradient elution.The column temperature was 30 and the detection wavelength was set at 325 nm.Results Chlorogenic acid,cichoric acid,caffeic acid and luteolin showed good linear relationship at the ranges of 5-100 g/ml,and the average recoveries were 99.83%-102.05%.The detection limits were 0.11 ng,0.09 ng,0.06 ng,0.07 ng,respectively;and the quantitation limits were 0.36 ng,0.30 ng,0.19 ng,0.24 ng,respectively.RSDs of precision test,stability test,repeatability test and intermediate precision test were all lower than 5%,and the durability was good.Conclusion This method is simple and reliable,so it can be used for the quality control of Taraxaci Herba.Key Words:Taraxaci Herba;chlorogenic acid;cichoric acid;caffeic acid;luteolin;HPLC蒲公英为菊科植物蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.）、碱地蒲公英（Taraxacum borealisinense Kitam.）或同属数种植物的干燥全草1。其作为一种优质的药食同源植物，具有清热解毒、散结消肿、利尿通淋的功效，应用广泛2-3。现代研究表明，蒲公英具有良好的抗炎、抑菌、降血糖、抗肿瘤和免疫促进等药理作用4-5，其主要活性成分为酚酸类、黄酮类和萜类物质6-7。食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第1期 85其中酚酸类成分主要有阿魏酸、绿原酸、咖啡酸、菊苣酸等，具有较强的抑菌活性8-9；黄酮类以木犀草素、槲皮素及其糖苷含量较高，具有抗炎、抗肿瘤等作用10-11。中国药典2020年版中仅以菊苣酸为蒲公英中有效成分含量控制的指标。目前未见有文献报道使用HPLC同时测定蒲公英中绿原酸、菊苣酸、咖啡酸、木犀草素。本实验建立了一种同时测定蒲公英中4种活性成分的HPLC检测方法，为蒲公英的质量控制提供参考。1 仪器与试药1.1 仪器安捷伦1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；BSA124S型电子天平（德国Sartorius公司）；KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山超声仪器）。1.2 试药菊苣酸对照品（批号：Y02J12Y136139，上 海 源 叶 生 物 科 技），咖 啡 酸 对 照 品（批号：M 1 8 0 8 3 0 8 1 8）、绿 原 酸 对 照 品（批号：C12432959）、木犀草素对照品（批号：C12369288）（上海麦克林），纯度98%；蒲公英药材，购自河南（批号：20210814）、安徽（批号：20210420，20210925）、山西（批号：20210510）、甘肃（批号：20210522）、湖南（批号：20210826）等不同产地，经江苏大学药学院欧阳臻教授鉴定为菊科植物蒲公英的干燥全草；甲醇、乙腈和乙酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。2 方法与结果2.1 混合对照品溶液的制备分别精密称取绿原酸、菊苣酸、咖啡酸、木犀草素对照品5.0 mg，用移液枪加入甲醇5.0 ml，涡旋至其完全溶解，制成质量浓度均为1.0 mg/ml的对照品储备液。精密吸取各对照品储备液适量，用甲醇稀释成浓度均为100 g/ml的混合对照品溶液。2.2 供试品溶液的制备取蒲公英药材适量，粉碎，精密称取蒲公英粉末1.0 g，置于锥形瓶内，加入超纯水10 ml，40 超声提取40 min，放冷至室温，3700 r/min离心10 min后取上清，经0.22 m微孔滤膜滤过，取续滤液得供试品溶液。2.3 色谱条件色谱柱为InertSustainTM ODS-C18柱（250 mm4.6 mm，5 m）；流动相为乙腈（A）-0.1%乙酸水溶液（B），梯度洗脱（020 min，10%45%A）；流速为1 ml/min；进样量为20 l；柱温为30；检测波长为325 nm。2.4 方法学考察2.4.1 色谱条件考察 按2.3项下色谱条件进样，混合对照品溶液及蒲公英供试品溶液的色谱图见图1。绿原酸、菊苣酸、咖啡酸、木犀草素与其相邻色谱峰分离度均大于1.5，各色谱峰理论塔板数均不低于5000。t/min1.绿原酸；2.菊苣酸；3.咖啡酸；4.木犀草素图1 混合对照品溶液（A）和蒲公英供试品溶液（B）的HPLC图谱2.4.2 线性关系考察 精密吸取2.1项下混合对照品溶液适量，用甲醇定量稀释成绿原酸、菊苣酸、咖啡酸、木犀草素浓度均为5，10，25，50，100 g/ml的混合对照品溶液。按2.3项下色谱条件依次进样测定，记录峰面积。以各对照品的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数，结果见表1。结果表明，4种成分在5100 g/ml浓度范围内与各自峰面积的线性关系良好。2.4.3 检测限与定量限 取2.4.2项下5 g/ml混合对照品适量，用甲醇稀释至不同浓度。按2.3项色谱条件进样，以3倍信噪比作为各成分的检测限，以10倍信噪比作为各成分的定量限，测定仪器所能检出和定量的最低质量浓度，结果见表1。结果表明，在本方法设定的线性范围内可准确测定各成分的含量。86 食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第1期表1 绿原酸、菊苣酸、咖啡酸、木犀草素线性关系、检测限及定量限考察结果成分回归方程R2线性范围/gml-1检测限/ng定量限/ng绿原酸y=22.24x+45.16 0.996651000.110.36菊苣酸y=32.88x-53.90 0.999951000.090.30咖啡酸y=76.27x+30.82 0.999751000.060.19木犀草素 y=51.69x+17.08 0.998851000.070.242.4.4 精密度试验 精密吸取低（5 g/ml）、中（50 g/ml）、高（100 g/ml）3个浓度的混合对照品溶液，按2.3项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积，计算精密度，4种成分在3个浓度下的RSD均小于2%，表明仪器精密度良好（见表2）。表2 4个成分的精密度试验结果浓度/gml-1成分测得量/gml-1RSD/%5绿原酸4.984.945.034.965.065.01 0.90 菊苣酸4.924.864.934.925.005.01 1.14 咖啡酸4.945.015.044.955.035.03 0.88 木犀草素 4.975.024.914.964.955.04 0.96 50绿原酸50.98 51.24 50.20 50.24 49.69 50.21 1.14 菊苣酸50.25 49.12 49.50 49.46 50.39 49.24 1.07咖啡酸50.73 51.25 50.49 50.76 49.90 50.81 0.88 木犀草素 50.37 51.40 50.47 50.65 50.24 50.36 0.84 100绿原酸 102.73 103.14 100.76102.01100.72 100.43 1.14 菊苣酸99.79 98.16 99.60 99.69 99.98 101.90 1.20 咖啡酸99.56 101.88 100.93101.72 102.91 99.12 1.44 木犀草素 99.09 101.85 100.87101.33100.37 99.63 1.032.4.5 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一批蒲公英粉末（批号：20210420）6份，每份1.0 g，分别精密加入4个对照品适量（与1.0 g样品中各待测成分的量相当），按2.2项下方法制备蒲公英供试品溶液，稀释1倍后，按2.3项下色谱条件测定，记录峰面积。计算加样回收率及RSD，结果见表3。4种成分的平均加样回收率在99.83%102.05%之间，RSD均小于3%，表明本方法准确性良好。2.4.6 稳定性试验 取同一供试