Box-Benhnken响...花紫薇中科罗索酸的提取工艺_林艾和.pdf

基金项目:云南省高校中西医结合防治甲状腺病重点实验室。作者简介:林艾和(19)，女，硕士研究生。研究方向为中药药理研究与应用。E mail:769553854 通信作者:范源(19)，主任医师，教授，博士。研究方向为中药药理研究与应用。E mail:1647909799 Box Benhnken 响应曲面法优化大花紫薇中科罗索酸的提取工艺林艾和1朱培芳1李蓉1夏宗霄1龙小妹1郭爽1范源1，2*1 云南中医药大学，云南昆明650500;2 云南中医药大学第二附属医院，云南昆明650216【摘要】目的:优选大花紫薇中三萜类化合物科罗索酸的最佳提取工艺。方法:采用 HPLC 建立大花紫薇中 CA 含量测定方法，以 CA 含量为评价指标，通过响应曲面法优化工艺，考察乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取次数对 CA提取效果的影响。结果:CA 分离度良好，在 0.480 2.880 g(r=0.9999)范围内呈良好的线性关系，平均加样回收率为99.97%(SD=0.58%)。最佳提取工艺条件为采用 95%乙醇、料液比为 120 g/mL、回流提取 60 min，提取 2 次。结论:本研究建立的方法结果准确、重复性好，可用于合理优化大花紫薇中 CA 的提取工艺。【关键词】大花紫薇;Box Benhnken;提取工艺;科罗索酸【中图分类号】284.2【文献标志码】A【文章编号】1007 8517(2023)01 0037 06Box Behnken esponse Surface Methodology for Optimization of Extraction Process ofCorosolic Acid from Lagerstroemia speciosaLIN Aihe1ZHU Peifang1LI ong1XIA Zongxiao1LONG Xiaomei1GUO Shuang1FAN Yuan1，2*1 Yunnan University of Chinese Medicine，Kunming 650500，China;2 Yunnan University of Chinese Medicine/Second Affiliated Hospital of Yunnan College ofTraditional Chinese Medicine，Kunming 650216，ChinaAbstract:Objective To optimize the extraction process of Corosoic acid from Crape Myrcus macrophylla Methods HPLC was used toestablish a method for the determination of Ca content in Cryptophylla grandiflorum With Ca content as the evaluation index，response sur-face methodology was used to optimize the process The effects of ethanol volume fraction，liquid solid ratio，extraction time and extractiontimes on the extraction efficiency of Ca were investigated esults The Ca separation was linear in the range of 0.480 2.880 g(r=0.9999)The average recovery was 99.97%(SD=0.58%)The optimal extraction conditions were as follows:95%ethanol，liquid tosolid ratio of 120 g/mL，reflux extraction for 60 min，extraction twice Conclusion The method established in this study was accurate andreproducible，and could be used to optimize the extraction process of CA from Crape Myrrh macrophyllaKey words:Lagerstroemia speciosa;Box Behnken;Extraction Process;Corosolic Acid大花紫薇(Lagerstroemia specious L.)，又名大叶紫薇(Lagerstroemia flos reginae etz)，是千屈菜科(Lythraceae)紫薇属(Lagerstroemia)的落叶乔木1。其原产于亚洲热带，分布于斯里兰卡、印度、马来西亚、菲律宾等地区2，在我国广东、广西地区有较丰富的资源。上世纪90 年代起，日本、美国以及菲律宾学者开始系统研究大花紫薇化学成分及功能 3，其广泛用于治疗糖尿病及肾病 4，在多个国家已经被开发为茶饮料，广泛用于治疗和预防糖尿病，被誉为“天然植物胰岛素”5，此外，其还具有减脂、抗氧化、抗菌和抗肿瘤等作用 6。近年来，随着对大花紫薇的研究深入，发现其降血糖的活性成分主要是鞣质类 5，7 8 和三萜类成分 9 10，其中三萜类主要活性成为科罗索酸 11，其具有胰岛素样作用且可抑制 淀粉酶和 糖苷酶活性 12 14。科罗索酸(corosolic acid，CA)，又名 2 羟基熊果酸15，具有降血糖、改善糖尿病性肾损伤、抗肿瘤、抗炎、降血压、抗菌等药理作用16 19。其主要存在于大花紫薇、枇杷、北五味子等植物中20，现关于在大花紫薇中提取 CA 相关报道较少，本实验研究建立大花紫薇中 CA HPLC 定量分析方法，同时采用响应曲面法优化其提取工艺，为在大花紫薇中提取 CA 的工艺研究和对大花紫薇的后续开发利用提供科学依据。1仪器与试药1.1仪器YL 040S 语路超声波清洗机，深圳市即洁超声科技有限公司;Agilent 1200 高效液相色谱仪，DAD 检测器，AcclaimC30色谱柱(2.1 mm 73中国民族民间医药2023 年1 月第32 卷第1 期Chinese Journal of Ethnomedicine and Ethnopharmacy，2023，Vol.32，No.1150 mm，3 m)，美国 Agilent 公司;DFY 600 摇摆式高速万能粉碎机，永康式速锋工贸有限公司;D2KW D 电热恒温水浴锅，上海量壹科学仪器有限公司;T 1000 型电子天平，上海浦春计量仪器有限公司;AB265 S 十万分之一分析天平，Mett-ler Tolido International Trade(Shanghai)Co.LTD;旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司。试剂:科罗索酸(CA 批号:wkq20042404，纯度98%，四川省维克奇生物科技有限公司)。甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。药材:大花紫薇 Lagerstroemia specious L.(批号:P20200819，安国市旭芳中药材经营有限公司)经云南中医药大学李国栋副教授鉴定为千屈菜科 Lythraceae 紫薇属 Lagerstroemia 植物大花紫薇的干燥全草。2方法与结果2.1样品测定方法2.1.1色谱条件色谱柱:AcclaimC30色谱柱(2.1 mm 150 mm，3 m);流动相:甲醇(B)乙腈(C)0.1%磷酸水溶液(D);梯度洗脱:0 10 min 75%B，12.5%C，12.5%D;10 20 min 70%B，15%C，15%D;流速:0.1mL/min;检测波长:210 nm;柱温:20;进样量:10 L。理论塔板数按科罗索酸计算应不低于5000，分离度大于 1.5。色谱图如图 1 所示。2.1.2混合对照品溶液制备分别精密称取 CA对照品 2.40 mg，置 10 mL 量瓶中，用甲醇配制成CA 浓度分别为 0.240 mg/mL 的混合对照品溶液，低温避光保存。ABA.对照品溶液;B.供试品溶液;1.科罗索酸图 1高效液相色谱图2.1.3供试品溶液制备取干燥的大花紫薇，粉碎，过 40 目筛，精密称定约 2.0 g，置于圆底烧瓶中，加热回流，提取温度 90，设置不同料液比、加热回流时间、回流次数及乙醇体积分数，合并提取液，过滤。滤液于 60 减压回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解后移至 10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用 0.45 m 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。2.1.4线性关系考察取“2.1.2”项下混合对照品溶液，0.45 m 微孔滤膜膜过滤，依次精密吸取2 L、4 L、6 L、8 L、10 L、12 L，按“2.1.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。以对照品进样量(g)为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。CA 的回归方程为 y=604.24x+1.1333(2=0.9999)，线性范围为 0.480 2.880 g。2.1.5精密度考察精密吸取同一混合对照品溶液 10 L，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样 6次，结果 CA 的峰面积 SD 为 1.13%，表明仪器精密度良好。2.1.6稳定性试验按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，于室温放置 0 h、2 h、4 h、6 h、8h、10 h，按“2.1.1”项下色谱条件，以峰面积为指标进样分析，结果 CA 面积 SD 为 1.44%，表明供试品溶液在 10 h 内稳定。2.1.7重复性试验取同一批样品 6 份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，结果显示 CA 平均含量为2.3246 mg/g，SD 为 1.28%，表明该方法重复性良好。2.1.8加样回收率试验精密称取已知含量的同一批样品(每 1.0 g 大花紫薇含 CA 2.3246mg)粉末 6份，每份精密称取 1.0 g，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，加入 CA 对照品适量(约相当于 1.0g 样品中所含 CA 的量)，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，计算平均回收率。结果见表 1。2.2单因素实验采用加热回流法提取大花紫薇中的科罗索酸，将料液比、加热回流时间、回流次数及乙醇体积分数作为影响因素，固定其中 3 个因素，以提取率为评价指标，对另一个因素进行单一因素实验。固定提取时间为60 min，提取次数为 1 次，料液比为 110 g/mL，考察乙醇体积分数(75%、80%、85%、95%、100%)对提取率的影响，优选最佳乙醇体积分数，按所优选条件依次向下考察料液比(110 g/mL、115g/mL、120g/mL、125 g/mL)，提取时间(40 min、60 min、80 min、100 min、120 min)，提取次数(1 次、2次、3 次)对醇提的影响。结果图2 表明，CA 含量随乙醇体积分数升高而增加，由于 CA 是脂溶性物质，不溶于水，随着乙醇体积分数的增加其含量增加，当乙醇体积分数为95%和100%时，CA 含量相差不明显，考虑实验成83中国民族民间医药2023 年1 月第32 卷第1 期Chinese Journal of Ethnomedicine and Ethnopharmacy，2023，Vol.32，No.1本，故选择乙醇体积分数为 95%21;CA 含量随料液比从110 g/mL 到 125 g/mL 先增加后减少，可能因为为溶剂体积过小，CA 无法彻底溶解，但溶剂体积过大，更易溶出其他的杂质达到饱和 22，继续增大料液比不会增加溶出率，故选择料液比 120 g/mL;CA 含量随提取时间从40 120 min 先增加后减少，CA 溶出率一定时间内随着